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目的(1)构建低氧响应性的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,简称VEGF)真核表达载体,建立体内、外递送方法并对其效能进行鉴定;(2)以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Polylactic acid-glycolic acid copolymer,PLGA)作为药物载体,探讨载体粒径对化药、核酸等不同药物释放的影响,优化针对不同药物的载体粒径参数;(3)针对心肌梗死后的急性氧化应激与长期的缺氧微环境特征,采用模块化和可控的层层组装技术开发具有急性抗氧化与低氧响应型VEGF调控表达的智能药物递送系统;(4)在体外细胞模型与心肌梗死小鼠模型中,对上述智能药物递送系统的心肌保护与心梗修复功能进行系统研究,以期建立新型的心肌梗死干预方法。方法(1)应用基因重组技术,在真核表达载体pGL4.73[hRluc/SV40](pSV)质粒基础上,将2个串联的低氧敏感性EPO增强子插入启动子SV40上游,构建低氧响应型表达系统(pEPO-SV),以海肾荧光素酶(Rluc)为下游报告基因,评价其低氧敏感性能;随后,将VEGF165基因取代Rluc插入到pEPO-SV质粒,同时插入到无EPO增强子的pSV质粒作为对照,分别获得pEPO-SV-VEGF和pSV-VEGF表达载体;体外,分别将表达Rluc或VEGF165的pSV质粒与pEPO-SV质粒转染293T细胞,在常氧和低氧条件下处理不同时间后,通过Rluc或VEGF165的表达对构建载体低氧诱导功能进行鉴定;(2)分别采用超声乳化与机械搅拌乳化方法制备纳米级与微米级两种PLGA颗粒,采用透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)和激光粒度及电位分析仪对两种颗粒的理化特征进行分析,并且对载药功能、进入细胞等特征进行系统比较,此外,利用PLGA纳米颗粒在体外293T细胞中进行质粒递送并进行功能验证,进行为针对不同目的的药物载体选择奠定基础;(3)采用超声乳化的方式制备PLGA纳米粒,以PLGA纳米粒为核,其内包含抗氧化药物褪黑素,随后利用电荷相互作用的原理,通过层层累积方法制备“保护层@低氧敏感VEGF系统@抗氧化核”结构的多层纳米药物系统。采用透射电镜(TEM)、激光粒度及电位分析仪、傅里叶转换近红外光谱分析等对其理化性能进行表征,并且通过圆二色谱仪及动物活体成像仪表征质粒的结构及功能特性,并测定质粒及褪黑素的缓释曲线。(4)从新生SD大鼠心脏中提取原代心肌细胞,分为以下5组进行处理:1.空白未处理组,2.氧气-血清剥夺组,3.氧气-血清剥夺+褪黑素纳米颗粒处理组,4.氧气-血清剥夺+褪黑素/pSV-VEGF质粒纳米颗粒处理组,5.氧气-血清剥夺+褪黑素/pEPO-SV-VEGF质粒纳米颗粒处理组。采用Tunel染色检测细胞凋亡情况;利用活性氧检测试剂盒检测抗氧化情况;通过RT-PCR检测涉及质粒处理组的目的基因VEGF的RNA水平表达情况。在此基础上,通过冠状动脉左前降支结扎制备小鼠心梗模型,随机分为以下几组进行处理:1.空白心梗组,2.心梗+褪黑素纳米颗粒处理组,3.心梗+pEPO-SV-VEGF质粒纳米颗粒组,4.心梗+褪黑素-pEPO-SV-VEGF质粒纳米颗粒处理组。通过Tunel染色等评估其对小鼠心肌梗死模型早期调亡的影响;通过超声心动图检测小鼠心脏功能;通过Massion染色,免疫组织化学染色评价小鼠心肌梗死模型的心肌梗死面积及血管密度,来验证该系统的体内治疗效能。结果(1)在质粒重组构建中,分别通过酶切、PCR和DNA测序证实了EPO增强子和VEGF165基因的成功插入与正确性;低氧诱导pEPO-SV质粒与原质粒pSV分别转染293T细胞后,正常培养条件下报告基因Rluc与目的基因VEGF165表达均无明显差别,而在低氧情况下重组子pEPO-SV中Rluc与VEGF165表达明显高于pSV,表明所构建的pEPO-SV质粒具有典型的低氧诱导表达活性。(2)所制备的纳米粒粒径主要分布在200-300纳米,微米颗粒直径主要分布在2-4微米;在化学药物褪黑素携带能力方面,PLGA纳米粒载药量与微米颗粒载药量相当,分别为14.3%和14.1%;在药物缓释方面,纳米颗粒存在显著的早期突释现象;微米颗粒释放时间较长,持续缓释可达一周左右;在核酸药物携带方面,PLGA纳米颗粒载药能力(6.04%)优于微米颗粒(1.18%);在核酸缓释方面,纳米颗粒载体持续缓释能力优于微米颗粒载体;在携带药物进入细胞能力方面,粒径相对小的PLGA纳米粒更容易进入或与细胞结合,共孵育12小时即达到最大值,微米颗粒相对较慢,最大值出现在共孵育24小时后。利用PLGA纳米颗粒在体外293T细胞中进行pEPO-SV与pSV递送后,正常培养条件下与低氧条件下对报告基因Rluc的检测显示与第一部分一致的结果,表明PLGA纳米颗粒能够作为质粒递送的有效载体。(3)TEM与SEM结果显示所制备的纳米粒结构规整,大小较均一,呈典型的球形结构。同时TEM和激光粒度仪及电位分析仪结果显示随着层层叠加效应,该结构的粒径呈现逐层增加现象;每层电位亦可见正负相互作用。CD谱仪检测结果显示质粒在该多层结构中能保持其结构的稳定性,并且活体成像仪检测结果表明该多层结构能够作为质粒胞内递送的有效载体,多层颗粒中褪黑素的缓释与单纯的纳米颗粒相比并没有受到明显影响,48h内几乎缓释完全;而质粒的缓释则相对较慢,可持续一周。(4)与未处理的低氧血清剥夺组相比,携带褪黑素的纳米颗粒处理显著减轻了低氧-血清剥夺环境下心肌细胞凋亡(P<0.01),同时活性氧水平也被显著抑制(P<0.01);PCR结果显示与携带pSV-VEGF质粒的纳米颗粒处理组相比,携带pEPO-SV-VEGF质粒的纳米颗粒处理组的目的基因VEGF表达明显增高(P<0.05)。体内心梗组织检测结果:Tunel染色结果显示与未处理对照组相比,携带褪黑素的纳米颗粒处理组显著减轻心肌梗死模型早期细胞调亡,改善心功能(P<0.05);携带pEPO-SV-VEGF质粒的纳米颗粒处理组心梗区血管化明显增多;同时携带褪黑素与pEPO-SV-VEGF质粒的纳米颗粒处理组显示出心梗修复的协同作用,超声、Massion染色等结果一致显示褪黑素与pEPO-SV-VEGF质粒纳米颗粒治疗组心梗修复效果最好(P<0.05)。结论(1)成功建立了典型的低氧响应性VEGF真核表达系统,这一低氧响应性表达载体在缺血、缺氧等组织损伤疾病中将可能具有重要应用前景。(2)PLGA纳米颗粒作为化学药物载体更适合于急性组织或细胞保护,微米颗粒更适合于慢性持续性保护;作为核酸质粒的载体,PLGA纳米颗粒是优于微米颗粒的更好选择,并建立起胞内质粒有效递送方法。(3)通过层层累积方法,成功制备了携带抗氧化药物褪黑素与低氧敏感VEGF质粒的双功能纳米载体,利用这一载体共递送VEGF质粒和褪黑素,在体外心肌细胞缺氧-血清剥夺模型下证明了该系统具有显著的心肌细胞保护功能,并且能在心梗修复中发挥显著的协同效应,促进心梗修复。