研究背景:胶质瘤(Glioma)在人类神经系统肿瘤中是最常见、治疗最困难的原发性肿瘤,在颅内肿瘤中它的发病率占40%以上。尽管近几年来针对脑胶质瘤的治疗,如手术、放疗、化疗等技术都取得了很大的进步,但是胶质瘤的总体治疗效果并没有得到显著的提高。丁酸是摄入的膳食纤维在肠道内由细菌发酵产生的一种天然的四碳短链脂肪酸(SCFAs),在体内主要是以丁酸钠(Sodium butyrate,Na B)的形式存在。近年来研究发现丁酸钠在肠道内能够发挥抗菌作用,不仅起到促进肠道上皮细胞的再生和修复、调节肠道微生态平衡的作用,而且还具有减轻体重、改善胰岛素抵抗的作用。同时,丁酸钠也可以通过抗炎、抗氧化、抑制凋亡等途径发挥神经保护作用。不仅如此,丁酸钠还具有抑制多种肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡的作用。线粒体是细胞能量来源和细胞能量代谢的主要场所,它主要通过以下三个方面对细胞的生长进行调控:(1)产生ATP,(2)维持线粒体膜电位(Δψm)的稳定,(3)释放凋亡相关因子。其中在细胞凋亡机制中,线粒体膜通透性改变(mitochondrial permeability transition,MPT)是关键环节,它对细胞凋亡的调控主要是通过线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)来进行的。当线粒体膜通透性转换孔的开放异常增多,就会引起线粒体Δψm下降、使线粒体膜通透性(mitochondrial membrane permeability,MMP)增加,呼吸链与氧化磷酸化解耦连、ATP合成减少,最终造成细胞的凋亡。ANT(adenine nucleotide translocator)即ADP/ATP载体,是线粒体内膜的主要转运蛋白,是在六十年代初期发现的,它是线粒体内膜最丰富的蛋白质之一。细胞内ADP和ATP的交换受质子电化学梯度的控制,通过电泳机制将一个ADP交换为一个ATP分子。而ANT在MPTP的形成和开放过程中主要起调节作用,具有使线粒体基质ATP和胞质ADP进行交换的能力,并且可以控制细胞内ATP的产生。ANT作为线粒体载体转运蛋白家族的成员,是线粒体内膜中最丰富的载体,因此它在转运蛋白家族中受到了越来越多的关注。且目前在胶质瘤的治疗中还未有对ANT及线粒体膜通透性的研究,因此,本课题通过研究丁酸钠对线粒体膜通透性的影响,探究丁酸钠对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的调节机制。研究目的:本研究使用丁酸钠来处理体外培养的人胶质瘤U251细胞,通过研究丁酸钠对线粒体膜通透性的影响,探究丁酸钠对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的调节机制。研究内容和方法:本课题主要研究了丁酸钠通过线粒体膜通透性对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响,探究丁酸钠对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的调节机制。取体外培养的胶质瘤U251细胞,待细胞生长至对数生长期时,给予剂量分别为0、1、2.5、5、10、20 mmol/L的丁酸钠处理,使用CCK8法测定各组细胞的增殖活性,使用流式细胞术检测各组细胞的凋亡水平以及线粒体膜电位水平,使用ATP检测试剂盒检测各组细胞的ATP的表达水平,使用Seahorse仪器检测各组细胞线粒体的功能变化,使用蛋白质印迹法检测各组细胞的通道蛋白ANT2以及凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase3和Cleaved-caspase3的蛋白表达水平。研究结果:在丁酸钠处理U251细胞后,结果发现,与对照组相比,丁酸钠显著降低了U251细胞的增殖活性,且呈剂量依赖性(P<0.01);同时对细胞的IC50做了检测,结果发现,IC50值为15.3 mmol/L。与对照组比较,丁酸钠使U251细胞的凋亡率得到了显著增加,且呈剂量依赖性(P<0.05);丁酸钠使U251细胞的ATP生成水平显著降低,具有剂量依赖性(P<0.01);丁酸钠显著降低了U251细胞的线粒体膜电位,不仅具有剂量依赖性(P<0.01),而且具有时间依赖性(P<0.05)。在加入丁酸钠以后,与对照组比较,丁酸钠增加了线粒体的功能;同时与对照组和丁酸钠组比较,ANT激动剂没有明显增加丁酸钠的作用,但ANT抑制剂却可以显著抑制丁酸钠的作用。与对照组比较,丁酸钠使Bcl2和Caspase3的蛋白表达水平降低(P<0.05),但增加了ANT2、Bax和Cleaved-caspase 3的蛋白表达水平(P<0.05)。结论:本研究结果表明丁酸钠通过激活ANT2增加U251细胞的线粒体膜通透性,降低U251细胞的线粒体膜电位,使ATP的生成减少,从而使细胞凋亡增加、增殖减少。因此本研究可以说明,丁酸钠通过调节ANT的功能改变了线粒体膜通透性,影响了胶质瘤的增殖和凋亡。从而说明丁酸钠可以对胶质瘤的预防和治疗起到重要的神经保护作用。