研究背景急性肾功能衰竭(ARF)是一种较常见的临床重、危、急症,出血、严重的创伤、休克、肾移植等都能导致急性肾衰。尽管重症监护和血液净化技术的应用能改善急性肾衰的预后,但在急危重病人中急性肾衰的死亡率仍然比较高。在动物实验模型证明使用多巴胺、心房钠尿肽、胰岛素生长因子和内皮细胞受体拮抗剂是有效的,但临床使用缺乏有效性。因此我们急需研究和寻求更实用和及时的治疗方法。急性肾损伤的重要病理生理机制是多方面的,近十余年来ARF发病机理的研究进展主要是缺血再灌注肾损伤学说、细胞代谢障碍肾损伤学说及肾血流动力变化学说。其中缺血再灌注损伤是急性肾损伤(AKI)共同的发病机制,缺血后灌注不足导致缺氧,缺血缺氧时间较长或氧分压较低时,超出了肾脏的低氧耐受能力,肾就会出现低氧损害性变化,出现细胞变性、坏死,以近端及皮髓交界处的肾小管上皮细胞损伤为重。随后的再灌注引起的肾小管上皮细胞急性炎症反应最终导致ARF的发生。缺血再灌注肾损伤与缺氧复氧性肾小管上皮细胞损伤的实质有非常类似之处。最近的研究表明活性氧、一些炎性因子如细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),炎性细胞浸润与肾脏的缺血再灌注损伤有关,特别是活性氧的作用。急性炎症反应表现为多种炎症细胞、细胞因子、趋化因子、黏附分子等炎症因子的表达,已有研究证明降低氧化应激水平,抑制核转录因子(NF-kB)炎症反应通路,减少ICAM-1、MCP-1的表达,可减轻缺血再灌注肾损伤。中医药在肾脏病治疗方面积累了丰富的经验,传统中药治疗注重整体调节,强调多环节发挥作用,具有独特的优越性,在多种复方制剂中,黄芪和当归为常用药物。动物实验研究发现黄芪当归合剂可降低肾缺血再灌注损伤大鼠血肌酐水平,缩短其恢复正常的时间,明显减轻肾组织病理改变,表明黄芪当归合剂可减轻急性缺血/再灌注导致的肾组织损伤。黄芪当归生药来源广泛,价格低廉,如能推广到临床应用,将会产生良好的社会效益。同时有研究表明他汀类在肾缺血再灌注损伤的保护作用与抑制炎症反应,抗氧化和血管保护作用有关。也有研究报道在可能发生急性肾衰的情况下如夹闭肾动脉手术、肾移植、ICU重症等患者提前预防性使用他汀类药物与保护肾功能有联系,但临床急性肾衰多发生在出血、休克、严重创伤等不可以预料的情况,在这些不可预料的情况下我们无法提前预防用药。而目前的实验研究也多停留在缺血再灌注之前使用中药(即预防用药)。在缺血再灌注肾损伤发生后再予以黄芪当归合剂及他汀类药物干预是否有肾脏保护作用,这对临床应用的指导意义更大,鉴于黄芪当归与他汀类药物有类似的抗氧化及抗炎症效应,我们假设延迟使用黄芪当归也能减轻肾缺血再灌注损伤,联合应用他汀类药物能获得更好疗效,从而为临床应用于急性肾衰竭的预防和治疗提供理论依据。研究方法：我们利用急性缺血再灌注肾损伤大鼠模型和缺氧复氧肾小管上皮细胞(HK2)模型,采用如下方法观察黄芪当归合剂及他汀类药物对急性缺血再灌注肾损伤的预防性保护作用：1.制备急性缺血再灌注肾损伤动物模型和缺氧复氧肾小管上皮细胞模型：1.1急性缺血再灌注损伤动物模型制备：3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射,取腹部正中切口进入腹腔,先暴露右肾,钝性分离肾周脂肪及筋膜,游离出右肾动静脉,用缝合线双层结扎动静脉,切除右肾。然后暴露左肾,钝性分离肾周脂肪及筋膜,小心分离左肾动静脉及其分支,用无创动脉夹夹闭左肾动脉60min后打开动脉夹,观察肾脏由苍白变为鲜红,表明再灌注成功。假手术组暴露双肾并分离肾周组织,切除右肾但不夹闭左肾动脉,其余处理同手术组。1.2缺氧复氧肾小管上皮细胞模型：取复苏后第3-4代人近曲肾小管上皮细胞,调整细胞终浓度为1×106/ml,种入6孔培养板,在37℃、95%02、5%C02环境中培养24h,然后换无糖Hank’s液,将培养板置于持续95%N2、5%CO2平衡的孵育容器中60min,再换不含血清的(roswell park memoria1institute1640, RPMI1640)培养液在95%O2、5%CO2环境中继续培养60min。正常对照组只在37℃、95%O2、5%CO2环境中持续培养120min。2.动物实验分组及给药方法：(1)假手术组(Sham组)；(2)单纯缺血再灌注手术组(IR组单纯缺血1h再灌注24h)；(3)黄芪当归合剂组(AAM组再灌注前30min黄芪当归合剂5g/ml腹腔注射)；(4)阿托伐他汀组(ATO组再灌注前30min阿托伐他汀lmmol/L腹腔注射)；(5)联合用药组(AAM&AT0组再灌注前30min黄芪当归合剂(5g/m1)+阿托伐他汀(lmmol/L)腹腔注射。造模成功率92%,缝合伤口后在正常条件下喂养24h自由饮食。3.细胞实验分组：①正常对照组；②单纯缺血缺氧组；③缺氧复氧+100μ g/m1黄芪当归合剂组(astragalus-angelica mixture, AAM组)；④缺氧复氧+10μmol/L阿托伐他汀组(atorvastatin, ATO组)；⑤缺氧复氧+100μ g/m1黄芪当归合剂+10μmol/L阿托伐他汀(astragalus-angelica mixture&ator vastatin, AAM&ATO组)。4.黄芪当归合剂及他汀类药物对肾缺血再灌注大鼠肾功能的影响：4.1按预定时间留取血、尿标本后,用东芝全自动生化分析仪直接检测血、尿肌酐,并结合尿量计算内生肌酐清除率(Ccr)。4.2按预定时间收集肾组织标本,分别用2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液和10%中性甲醛固定液固定,常规制组织切片,光镜下观察肾组织形态学变化,Megyesi J等的方法稍加改进后进行肾小管计分。5.黄芪当归合剂及他汀类药物对急性肾缺血再灌注大鼠肾功能的作用及机制：5.1检测晚期氧化蛋白产物(AOPPs)：按时收集血标本,离心留取血清,采用比色法测定血清AOPPs.5.2检测血清丙二醛(MDA)：按时收集血标本,离心留取血清,采用硫代巴比妥酸反应法检测血清MDA。5.3观察肾组织ICAM-1.MCP-1表达：固定肾组织后切5μ m切片,免疫组织化学方法观察ICAM-1.MCP-1表达。5.4检测肾组织ICAM-1.MCP-1mRNA表达：采用实时定量RT-PCR法。取液氮中冻存肾组织,提取总RNA,逆转录后取2μL逆转录产物进行PCR扩增,应用RT-PCR System ABI7500仪器操作,得到的扩增曲线和溶解曲线用2-△△Ct法分析。MCP-1引物上游5’-ACGCTTCTGGGCCTGTTGTTCA-3’,下游5’-TGGGG CATTAACTGCATCTGGC一3’;ICAM-1mRNA引物上游5’-GCGACCACGGAGCCAATTTC TCAT-3’,下游5’-TCAGGACCCTAGTCGGAAGATCGA-3’;内参照采用GADPH,引物上游5’-GGAGCGAGACCCCACTAAC-3’,下游5’-GGCGGAGATGATGACCCTT一3’.6.黄芪当归合剂及他汀类药物对缺氧复氧肾小管上皮细胞的作用及其机制：6.1细胞内活性氧的测定用对活性氧(ROS)敏感的荧光探针2,72二氢二氯荧光素(DCFH)标记细胞,将标记细胞以2×105/孔加入96孔板,用VICTOR Wallac1420多标记分析系统(美国PE公司)在激发光485±10nm、发射光535±10nm,37℃条件下动态测定细胞内氧化DCFH产生的荧光量的变化,以此反映ROS的产生量。6.2ELISA法检测细胞上清ICAM-1、MCP-1浓度按时收集细胞上清及细胞,在细胞中加入细胞裂解液,制成蛋白溶液,按操作说明检测细胞上清中ICAM-1、MCP-1的浓度,同时测蛋白溶液的蛋白浓度,计算每孔的蛋白数量。将测得的浓度除以相应孔的蛋白总量平衡各孔之间细胞数量的差异。6.3逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ICAM-1mRNA.MCP-1mRNA表达提取总RNA,逆转录后取2uI逆转录产物进行PCR扩增,PCR条件为：95℃变性1min,56℃退火30s,72℃延伸1min.MCP-1mRNA所采用的两条引物为：Sense Primer5’-TCAGCCAGATGCAATCAATGCCC-3’,Anti-sense Prim er5’-TGGGTTTGCTTGTCCAGGTGGT-3’,片段大小216bp:ICAM-1mRNA所采用的两条引物为Sense Primer5’-ACCTTCCTCACCGTGTACTGGhCT-3’,Anti-sense Primer5’-TGCGGCACGAGAAATTGGCT-3’,片段大小250bp：内参照采用β-Actin,两条引物为:Sense primer5’-AAGGATTCCTATGTGGGC-3’,Anti-s ense primer5’-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3’,片段大小536bp。取PCR扩增产物10μL在1%琼脂糖凝胶中电泳,用溴化乙锭染色,采用凝胶成像分析系统进行半定量。结果：一、黄芪当归合剂及阿托伐他汀对大鼠急性缺血再灌注肾损伤的保护作用及其机制研究1.黄芪当归合剂及阿托伐他汀降低急性缺血再灌注肾损伤Scr水平,升高Ccr。与假手术组相比,模型组单纯缺血再灌注引起Scr升高,Ccr下降,给予黄芪当归合剂、阿托伐他汀用药后,于再灌注24h Scr变化与模型组相比有明显差别,Scr于再灌注24h AAM组(171.88±40.96μ mol/L n=8).ATO组(189.0±31.85μ mol/L n=7)低于模型组(270.75±46.84μ mol/L n=8P<0.05),AAM&ATO联合用药组(119.55±46.07μ mol/L n=11P<0.05)更明显低于模型组。Ccr于再灌注24h AAM组(0.0026±0.00069ml/min n=8).ATO组(0.0030±0.00059ml/minn=7)高于模型组(0.0015±0.0004ml/min n=8P<0.05),AAM&ATO联合用药组(0.0053±0.0014ml/min n=11P<0.05)更明显高于模型组。2.黄芪当归合剂及阿托伐他汀减轻急性缺血再灌注肾损伤肾组织形态学损伤。光镜下缺血后再灌注24h AAM、ATO、AAM&ATO组与模型组可见皮髓交界处肾小管上皮细胞刷状缘脱落,肾小管扩张,小管腔内管型、肾小管坏死形成等病理改变,但是给药组的病变较模型组明显减轻,各给药组肾小管计分明显低于模型组(P<0.05)。3.黄芪当归合剂及阿托伐他汀降低急性缺血再灌注肾损伤氧化应激水平。硫代巴比妥酸反应法检测血清MDA结果显示：与假手术组相比,模型组单纯缺血再灌注引起MDA升高,给予黄芪当归合剂、阿托伐他汀用药后,于再灌注24hMDA变化与模型组相比有明显差别,MDA于再灌注24h AAM组(11.24±1.33μmol/L n=8)、ATO组(12.04±1.97μ mol/Ln=7)低于模型组(13.86±0.98μ mol/Ln=8P<0.05), AAM&ATO联合用药组(8.17±0.86μ mol/L n=7P<0.01)更明显低于模型组。比色法测定血清AOPPs结果显示：与假手术组相比,模型组单纯缺血再灌注引起AOPPs升高,给予黄芪当归合剂、阿托伐他汀用药后,于再灌注24hAOPPs变化与模型组相比有明显差别,AM组、ATO组、AAM&ATO组药物分别使AOPPs含量下降5%、3%和10%,黄芪当归和阿托伐他汀联合使用后能更明显下降缺血再灌注肾损伤后AOPPs水平。4.黄芪当归合剂及阿托伐他汀降低急性缺血再灌注肾损伤过程中炎症反应。免疫组织化学方法观察ICAM-1、MCP-1表达结果显示：假手术组肾脏组织ICAM-1、MCP-1未见明显表达,模型组手术后肾脏ICAM-1、MCP-1表达明显,主要位于皮髓交界处的肾小管及间质,近曲及远曲小管均见阳性染色；AAM组、ATO组、AAM&ATO联合用药组肾脏ICAM-1、MCP-1阳性染色明显弱于模型组。实时定量RT-PCR法结果显示：模型组肾组织ICAM-1mRNA、MCP-1mRNA表达明显高于假手术组,ICAM-1mRNA AAM组、ATO组、AAM&ATO联合用药组较模型组分别下降了6%、13%、16%。MCP-1mRNA AAM组、ATO组、AAM&ATO联合用药组较模型组分别下降了18%、8%、24%。二、黄芪当归合剂及阿托伐他汀对缺氧复氧肾小管上皮细胞的作用及其机制研究1.黄芪当归合剂及阿托伐他汀降低缺氧复氧后HK2细胞氧化应激水平。活性氧含量检测结果显示,单纯缺氧复氧组活性氧含量明显高于正常对照组和3组用药组(P<0.05)。AAM组、ATO组、AAM＆ATO组较单纯缺氧复氧组活性氧含量下降了11%、10%和31%,AAM&ATO组更明显下降缺氧复氧后HK-2细胞活性氧含量,黄芪当归合剂和阿托伐他汀之间可能存在交互作用(P<0.05)。2.黄芪当归合剂及阿托伐他汀降低缺氧复氧后HK-2细胞ICAM-1表达。ELISA法结果显示,正常对照组ICAM-1表达量为(0.19±0.02)ng/ml蛋白,单纯缺氧复氧组为(0.59±0.06) ng/ml蛋白,AAM组、ATO组、AAM&ATO组分别为(0.28±0.05)ng/ml蛋白、(0.22±0.03)ng/ml蛋白、(0.21±0.02)ng/ml蛋白。单纯缺氧复氧组与正常对照组、3组用药组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).(AAM&ATO组更明显降低缺氧复氧后HK2细胞ICAM-1表达,黄芪当归合剂和阿托伐他汀之间可能存在交互作用(P<0.05)。3,黄芪当归合剂及阿托伐他汀降低缺氧复氧后HK-2细胞ICAM-1mRNA表达。RT-PCR法结果显示,正常对照组ICAM-1mRNA表达量为(0.16±0.01)%,单纯缺氧复氧组为(0.27±0.02)%,AAM组、ATO组.AAM&ATO组分别为(0.20±0.01)%、(0.18±0.01)%、(0.15±0.01)%,单纯缺氧复氧组与正常对照组、3组用药组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。4.黄芪当归合剂及阿托伐他汀降低缺氧复氧后HK-2细胞MCP-1表达。ELISA法结果显示,正常对照组MCP-1表达为(1.92±0.83)ng/ml蛋白,单纯缺氧复氧组为(4.66±0.29)ng/ml蛋白,AAM组、ATO组、AAM＆ATO组分别为(2.04±0.79)ng/ml蛋白、(1.92±0.92)ng/ml蛋白、(1.82±1.04)ng/ml蛋白,单纯缺氧复氧组与正常对照组、3组用药组比较,差异均有统计学意义(P<0.01).AAM&ATO组更明显降低缺氧复氧后HK2细胞MCP-1表达,黄芪当归合剂和阿托伐他汀之间可能存在交互作用(P<0.05)。5.黄芪当归合剂及阿托伐他汀降低缺氧复氧后HK-2细胞MCP-1mRNA表达。RT-PCR法结果显示,正常对照组MCP-1mRNA表达量为(0.14±0.01)%,单纯缺氧复氧组为(0.26±0.02)%,AAM组、ATO组、AAM＆ATO组分别为(0.14±0.01)%、(0.16±0.01)%、(0.11±0.01)%,单纯缺氧复氧组与正常对照组、3组用药组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论：1.黄芪当归合剂、阿托伐他汀对缺血再灌注肾损伤具有保护作用,联合用药效果显著。2.黄芪当归合剂、阿托伐他汀对缺血再灌注肾损伤的保护机制可能与其抑制氧化应激和炎症反应有关。3.黄芪当归合剂、阿托伐他汀对HK-2缺氧复氧性损伤有保护作用,联合用药效果显著。4.黄芪当归合剂、阿托伐他汀对HK-2缺氧复氧性损伤的保护机制可能与其抑制其抑制氧化应激和炎症反应有关。