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研究背景急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是一种常见的可导致急性呼吸衰竭和死亡的疾病,在过去的几十年里,ALI的发病率和死亡率一直居高不下,目前没有有效的治疗手段和药物。法尼脂X受体(Farnesoid X receptor,FXR)是一种配体依赖的转录因子,在调节胆汁酸代谢中发挥重要作用,奥贝胆酸(obeticholic acid,OCA)是一种人工合成的FXR激动剂,研究表明FXR亦具有抗炎作用。LPS诱导的ALI模型是目前广泛被使用的急性肺损伤动物模型,本实验研究了OCA激活FXR后是否可以减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤,以及是否通过降低炎症信号通路进而减轻急性肺损伤。研究目的(1)OCA是否减轻了LPS诱导的小鼠急性肺损伤;(2)OCA是否通过抑制炎症信号进而减轻了LPS诱导的小鼠急性肺损伤。实验方法将60只雄性小鼠随机分为6组(每组10只),分别为Control组(即对照组),单纯OCA组,LPS-2h组,LPS-6h组,LPS+OCA-2h以及LPS+OCA-6h组。单纯OCA组小鼠,以及LPS+OCA-2h组和LPS+OCA-6h组小鼠在LPS注射前72h,48h和24h,分别灌胃补充OCA(OCA,5 mg/kg,溶于玉米油中),LPS组小鼠给予腹腔注射LPS(1.0 mg/kg,溶于盐水中),Control组和OCA组注射等体积生理盐水。在LPS腹腔注射后0h,2h以及6h剖杀小鼠,留取肺组织。观察肺系数以及病理的改变。制备肺泡灌洗液,用ELISA的方法检测小鼠血清以及肺泡灌洗液中的炎症因子。用RT-PCR方法检测肺组织中Tnf-α、Il-1β、Tgf-β、Kc、Mcp-1和Il-10的mRNA水平;用Western-Blotting方法检测NF-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号、MAPKs信号以及PI3K/Akt信号通路的蛋白表达。用免疫组化法检测FXR,NF-κB p65和NF-κB p50的阳性细胞定位。研究结果(1)OCA预处理改善LPS引起的小鼠急性肺损伤腹腔注射LPS成功诱导小鼠急性肺损伤模型,灌胃补充OCA可以明显减轻LPS诱导的急性肺损伤。LPS暴露后6 h小鼠绝对肺重量和相对肺系数,与Control相比是明显升高的;病理显示,补充OCA可以有效抑制LPS引起的肺水肿以及炎性细胞浸润,补充OCA明显降低了LPS上调小鼠急性肺损伤病理评分。研究结果显示OCA预处理可以有效减轻LPS引起的小鼠急性肺损伤。(2)OCA预处理减轻LPS引起的肺部促炎因子和趋化因子的升高小鼠肺组织中促炎因子Tnf-α,Il-1β,Tgf-βmRNA水平在LPS暴露后2 h和6h是明显升高的,补充OCA后,有效抑制了LPS引起肺部促炎因子的升高;LPS暴露后,肺中趋化因子Kc和Mcp-1 mRNA是明显上调的,补充OCA后,可以拮抗LPS引起的肺组织中趋化因子的升高;研究还发现,LPS暴露后,肺中抗炎因子Il-10 mRNA在2 h和6 h是明显升高的,补充OCA后,Il-10 mRNA水平在6 h更进一步升高。研究结果显示OCA不仅可以抑制LPS上调小鼠肺中促炎因子和趋化因子,同时还促进了抗炎因子的释放。(3)OCA预处理可以降低LPS引起的血清中炎性因子和趋化因子的释放LPS暴露后,血清中的促炎因子TNF-α水平是明显升高的,补充OCA后,有效抑制LPS暴露引起血清中促炎因子的升高;血清中的趋化因子KC在LPS暴露后明显上调了,补充OCA后明显抑制LPS上调血清中的趋化因子的释放。研究结果显示补充OCA可以抑制LPS上调小鼠血清中促炎因子和趋化因子的释放。(4)OCA预处理可以减弱LPS上调小鼠肺泡灌洗液中的的促炎因子和趋化因子的表达LPS暴露后,小鼠肺泡灌洗液中的促炎因子TNF-α水平是明显升高的,补充OCA后,有效抑制LPS引起的肺泡灌洗液中TNF-α的升高;同时,补充OCA可以抑制LPS暴露引起的小鼠肺泡灌洗液中趋化因子KC表达的上调。同时对肺泡灌洗液进行细胞计数发现,OCA可以降低LPS上调肺泡灌洗液中的炎性细胞数;肺泡灌洗液中的中性粒细胞和巨噬细胞的水平在LPS暴露后是升高的,OCA可以抑制LPS上调肺泡灌洗液中的中性粒细胞和巨噬细胞的含量。研究结果提示补充OCA可以降低LPS引起的肺泡灌洗液中促炎因子和趋化因子的释放。(5)OCA预处理可以缓解LPS激活小鼠肺中NF-κB信号LPS暴露后激活了肺中的NF-κB信号,NF-κB p65和NF-κB p50的核转位水平在LPS暴露后是明显增强的,补充OCA可以有效抑制LPS引起的肺组织中NF-κB p65和NF-κB p50的核转位;本课题进一步分析了肺中的NF-κB p65和NF-κB p50阳性细胞核数,免疫组化的结果发现OCA降低了LPS上调NF-κB p65和NF-κB p50的阳性细胞核数。研究结果提示补充OCA可以缓解LPS激活小鼠肺中NF-κB信号通路。(6)OCA预处理可以减轻LPS激活小鼠肺中MAPKs信号通路LPS暴露可以激活小鼠肺部MAPKs信号通路,肺中的ERK1/2,JNK和p38的磷酸化水平在LPS暴露后是明显增加的,补充OCA后明显减少了ERK1/2,JNK和p38的磷酸化水平。研究结果提示补充OCA可以减轻LPS激活小鼠肺中的MAPKs信号通路。(7)OCA预处理可以抑制LPS激活小鼠肺中PI3K/Akt信号通路LPS暴露可以激活小鼠肺中的PI3K/Akt信号通路,肺中的p-Akt的水平在LPS暴露后是明显上调的,补充OCA后有效减轻了LPS诱导的Akt的磷酸化。研究结果提示补充OCA可以抑制LPS激活肺中的PI3K/Akt信号通路。(8)OCA预处理可以激活小鼠肺组织中FXR信号为了分析OCA发挥抗炎作用的机制,本课题分析了肺组织中的FXR信号。结果发现:补充OCA后肺中Fxr mRNA水平无明显改变。进一步分析肺中的FXR阳性细胞核数发现,补充OCA后促进了小鼠肺中FXR核转位水平,LPS暴露后抑制了OCA上调肺中的FXR的核转位。研究结果提示,补充OCA激活了小鼠肺组织中FXR信号。研究结论本课题研究了肺中FXR的激活对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的拮抗作用,根据以上的研究结果,我们得出了如下的结论:(1)肺组织中FXR的激活对LPS引起的小鼠急性肺损伤有保护作用;(2)肺组织中FXR的激活减轻了LPS诱导小鼠中促炎因子和趋化因子的释放;(3)肺组织中FXR的上调抑制了LPS激活小鼠肺上NF-κB信号、MAPKs信号以及PI3K/Akt信号通路。以上结论提示FXR的激动剂可以在临床上被用来作为治疗炎症引起的急性肺损伤的药物,本研究为治疗以及预防急性肺损伤的药物应用提供一定的理论依据。