茵陈蒿汤出自东汉张仲景的《伤寒论》,由茵陈、栀子、大黄三味中药组成,主治湿热黄疸,是中医临床上保肝利胆的常用方剂。祛湿化瘀方是上海中医药大学附属曙光医院的临床验方,主治非酒精性脂肪性肝病(NAFLD),由茵陈、栀子、虎杖、田基黄、姜黄五味中药组成。两个复方的药效已在动物实验和临床应用中得到了验证,但由于药效成分不明确,使得复方的作用机制研究无法深入,也难以建立科学合理的质控方法和质量标准。本文采用体内外结合的中药及复方药效物质研究策略,在对复方提取物及大鼠口服提取物后体内(门静脉血、肝脏及外周血等)原型成分和代谢产物进行系统的定性定量分析及体内过程研究(包括体内代谢、药代动力学、靶组织分布等)基础上,锁定了在体内达到一定暴露量的主要原型成分及代谢产物,并通过细胞和动物模型进行活性筛选和药效验证,初步阐明了复方的主要药效成分群。同时,利用网络药理学手段对茵陈蒿汤和祛湿化瘀方中可进入体内的成分进行作用靶点和通路分析,初步建立起复方入体成分-靶点-疾病的作用网络,为深入研究两个方剂的作用机制提供线索。主要研究结果如下:1.茵陈蒿汤在正常大鼠和肝损伤大鼠中的代谢研究采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术对正常大鼠和四氯化碳诱导的肝损伤大鼠口服茵陈蒿汤后的门静脉血、肝脏和外周血样品进行定性分析,从代谢角度研究肝损伤状态是否会对茵陈蒿汤的体内代谢过程造成影响。从正常大鼠的含药门静脉血、肝脏和外周血样品中鉴定出10个原型成分,包括有机酸类化合物绿原酸和3,4-二咖啡酰基奎宁酸,木脂素酚类化合物4-羟基苯乙酮,香豆素类化合物东莨菪内酯,环烯醚萜类化合物京尼平龙胆双糖苷和京尼平苷,单萜类化合物4-羟基-2,6,6-三甲基-1-环己烯羧酸和Jasminodiol,蒽醌类化合物大黄酸和大黄素。通过对六种结构类型的质谱裂解规律进行解析和归纳,从正常大鼠体内鉴定出26个茵陈蒿汤的代谢物,其中门静脉血中25个、肝脏中9个、外周血中22个。茵陈蒿汤在正常大鼠体内的代谢途径包括水解、脱羧、脱羟基、氧化、甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸酯化,其中69%的代谢物为葡萄糖醛酸化和硫酸酯化代谢物。肝损伤大鼠口服茵陈蒿汤后,体内的原型成分与正常大鼠一致,而代谢物略有差别。与正常大鼠体内的代谢物相比,从肝损伤大鼠的门静脉血中检测出27个代谢物,多出的2个代谢物为芦荟大黄素葡萄糖醛酸结合物和大黄酚的硫酸酯。在肝损伤大鼠的肝脏中鉴定出7个代谢物,比正常大鼠少了2个(京尼平的葡萄糖醛酸结合物和大黄酚葡萄糖苷的葡萄糖醛酸结合物)。在肝损伤大鼠的外周血中鉴定出22个代谢物,数量与正常大鼠相同,但有3个代谢物结构不同,少了2个3,4-二咖啡酰基奎宁酸的脱羟基代谢物和1个京尼平的硫酸酯,同时多了2个蒽醌类二相代谢物(芦荟大黄素葡萄糖醛酸结合物和大黄酚的硫酸酯)和1个咖啡酸的甲基酯。从上述定性分析结果可以发现,四氯化碳诱导的急性肝损伤仅对茵陈蒿汤在大鼠体内的代谢物的数量和部分结构产生了较小的影响,而并未改变进入体内的原型成分。2.茵陈蒿汤在正常大鼠和肝损伤大鼠中的药代动力学、肝组织分布及主要成分的肝保护活性研究在上述系统定性分析基础上,利用HPLC-QQQ-MS/MS方法对茵陈蒿汤提取物及体内(门静脉血、肝脏、外周血)的原型成分和一个代谢物(京尼平)进行了定量分析,其中五个原型成分和京尼平能够在生物样品中被准确定量,五个原型包括京尼平苷、绿原酸、大黄酸、4-羟基苯乙酮、大黄素。在茵陈蒿汤提取物中,京尼平苷的含量最高(以1计),其他成分含量顺序依次为绿原酸(0.47)、大黄酸(0.01)、4-羟基苯乙酮(0.01)和大黄素(0.001)。大鼠口服茵陈蒿汤后,京尼平苷也是体内多部位暴露量最高的成分,但是其他成分的体内暴露量与提取物的含量顺序并不一致。例如,提取物中含量第二位的绿原酸在门静脉血和外周血中暴露量仅排在第三位且低于京尼平苷暴露量的10%,在肝脏中未检测到。大黄酸在门静脉血、外周血和肝脏中的暴露量均排在第二位,但其在提取物中的含量仅为京尼平苷的1%,且大黄酸在外周血中的暴露量高于门静脉血,提示其他蒽醌类成分可能通过肝脏代谢转化为大黄酸。对比正常动物和肝损伤动物体内化合物的暴露量发现,四氯化碳诱导的肝损伤会导致肝脏中大黄酸、4-羟基苯乙酮和大黄素的的暴露量降低约50%(P<0.001),这表明肝损伤会对茵陈蒿汤中部分成分的靶器官暴露量产生显著影响。前述对茵陈蒿汤体内成分的定性分析表明,正常动物和肝损伤动物体内原型成分和代谢产物的数量和种类差别不大,但定量分析显示部分成分在肝损伤动物体内尤其靶器官中的暴露量显著降低,提示对体内体外中药成分的研究不能只做定性,应定性定量同时进行,定性可以为定量奠定基础,但很多情况下定量往往更重要。对体内具有一定暴露量的六个成分进行细胞活性筛选。结果表明,六个化合物均可以不同程度地提高受损细胞的活力(P<0.01)及SOD水平(P<0.05),降低受损细胞的LDH水平(P<0.01);除了大黄素之外,其余五个化合物均可以显著降低受损细胞的AST和ALT水平(P<0.05)。在肝损伤大鼠模型上,体内暴露量最高的两个化合物京尼平苷和大黄酸均可以显著降低肝损伤大鼠的血清AST和ALT水平。以上结果表明,通过体内过程研究(尤其是体内多部位定量分析)锁定的京尼平苷和大黄酸两个化合物经细胞活性筛选和动物药效验证具有显著的抗肝损伤作用,初步确定为复方茵陈蒿汤主要的药效成分。3.基于网络药理学探讨茵陈蒿汤的肝保护作用机制针对大鼠口服茵陈蒿汤后肝脏中检测到的6个原型成分及血中活性成分同时也是君药茵陈的质控成分绿原酸进行网络药理学分析。建立了194个潜在作用靶点之间的PPI互作网络,并筛选出结点数最多的65个关键作用靶点。通过对这65个关键作用靶点进行富集分析发现,相关性最高的信号通路包括癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗信号通路、乙型肝炎信号通路、AGE-RAGE信号通路等。其中,PI3K-Akt信号通路与氧化应激、炎症反应、胰岛素抵抗以及肝纤维化等均有密切的关系,且京尼平苷、大黄素、大黄酸、东莨菪内酯、绿原酸五个化合物均可以通过调节PI3K-Akt信号通路来发挥活性,提示PI3K-Akt信号通路可能在茵陈蒿汤的肝保护活性中发挥重要作用,值得进一步深入研究。4.祛湿化瘀方提取物的化学成分及大鼠体内外代谢研究利用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术,从祛湿化瘀方水提物中鉴定出66个成分,主要包括有机酸类、环烯醚萜类、黄酮类、二苯乙烯类、蒽醌类和萘酚类等六种结构。在对主要原型成分的质谱裂解规律进行解析归纳基础上,对大鼠口服祛湿化瘀方提取物后的门静脉血、肝脏和外周血的原型和代谢产物进行分析,共鉴定出14个原型成分,包括茵陈中的三个有机酸类化合物(绿原酸、4-羟基苯乙酮、对羟基苯甲酸),栀子中的两个环烯醚萜类化合物(京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷),虎杖中的两个萘酚类化合物(决明酮硫酸酯)、两个二苯乙烯类化合物(虎杖苷、白藜芦醇)和四个蒽醌类化合物(大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素等),以及田基黄中的一个黄酮类化合物(槲皮素)。同时分析鉴定出34个代谢产物,二相代谢是其主要的代谢途径,同时羟基化和氢化分别是大黄素和白藜芦醇在体内最主要的一相代谢反应。此外,通过体外大鼠肠道菌代谢研究发现,绿原酸、环烯醚萜类糖苷、蒽醌类糖苷、二苯乙烯类糖苷、黄酮类糖苷等均可以在肠道菌的作用下快速水解,生成的代谢产物如咖啡酸、大黄素、白藜芦醇、槲皮素等也可以被继续代谢,表明肠道代谢在祛湿化瘀方的体内代谢过程中发挥重要作用。上述研究明确了祛湿化瘀方提取物中的主要成分及其在大鼠体内的代谢特征,并确定了复方中能够进入体内的14个原型成分以及主要的代谢物,为下一步定量分析提供了化学基础。5.小鼠单次及连续口服祛湿化瘀方的药代动力学、肝组织分布及抗NAFLD活性研究对祛湿化瘀方提取物中的主要成分进行含量测定,六个主要成分的含量高低顺序为京尼平苷(以1计)、虎杖苷(0.29)、京尼平龙胆双糖苷(0.17)、大黄素-8-O-葡萄糖苷(0.15)、绿原酸(0.11)、槲皮苷(0.06),其余成分的含量均低于京尼平苷的5%。考虑到NAFLD药效模型常采用小鼠建立,同时需连续多次给药,因此采用小鼠研究单次及连续口服祛湿化瘀方后主要成分的药代动力学和肝肾组织分布。不管是单次还是连续口服祛湿化瘀方提取物,小鼠的外周血、肝脏和肾脏中暴露量最高的均是京尼平苷。单次给药时,小鼠外周血中除京尼平苷以外的八个成分(虎杖苷、京尼平龙胆双糖苷、绿原酸、大黄素、白藜芦醇、4-羟基苯乙酮、京尼平、槲皮素)的暴露量总和仅为京尼平苷的5%;肝脏中暴露量最高的五个成分为京尼平苷(以1计)、白藜芦醇(0.24)、大黄素(0.11)、槲皮素(0.07)、虎杖苷(0.04);肾脏中暴露量最高的五个成分为京尼平苷(以1计)、京尼平龙胆双糖苷(0.03)、白藜芦醇(0.02)、大黄素(0.02)、4-羟基苯乙酮(0.01)。与单次给药相比,连续给药小鼠肝脏中白藜芦醇和槲皮素的暴露量分别显著下降了83%(P<0.01)和36%(P<0.05);肾脏中大黄素的暴露量提高了75%(P<0.01),白藜芦醇的暴露量则显著下降了58%(P<0.01),京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷和京尼平的暴露量也有降低(P<0.05)。另外,连续多次给药对外周血和肝脏中白藜芦醇的药时曲线产生了显著的影响,导致其曲线中的双峰消失。综合以上结果发现,不管是单次给药还是连续多次给药祛湿化瘀方提取物后,小鼠体内特别是靶器官中暴露量较高的成分主要是京尼平苷、大黄素和白藜芦醇。京尼平苷本身在提取物中的含量是最高的,同时提取物中含量第三位的京尼平龙胆双糖苷也可以在体内转化成京尼平苷。大黄素和白藜芦醇在提取物中的含量很低,根据前述代谢研究结果,体内的这两个成分应该分别是由提取物中含量第四位的大黄素-8-O-葡萄糖苷和第二位的虎杖苷脱糖代谢生成的。综合考虑上述体内外定性定量分析结果,我们最终选择京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷、虎杖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷和绿原酸五个成分配伍,在NAFLD小鼠模型上进行药效试验。结果表明,这五个成分组合可显著降低NAFLD小鼠肝脏中的TG含量(P<0.01),抑制肝脏脂肪沉积和变性,同时具有一定的肝保护活性。6.基于网络药理学探讨祛湿化瘀方治疗NAFLD的作用机制通过对祛湿化瘀方中进入体内的14个原型成分和一个主要活性代谢物进行网络药理学分析,建立了祛湿化瘀方入体成分-作用靶点-NAFLD三者之间的系统网络,网络中的关键靶点包括PTGS2、CASP3、MMP1、EGFR、MAOB、TNF、MMP2和PTPN1。通路富集分析结果表明,祛湿化瘀方抗NAFLD的通路主要包括代谢疾病相关通路、癌症相关通路、病毒感染的肝脏疾病、系统免疫及信号转导相关通路。这些初步结果提示祛湿化瘀方治疗NAFLD的潜在作用靶点和通路,为深入研究其作用机制提供了部分线索。