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抗体作为最重要的生物技术药物,具有重要的临床和经济价值,市场需求量大。以Protein A亲和层析为核心的抗体分离平台存在着一定局限,混合模式层析(MMC)是一种蛋白分离新方法,在抗体分离纯化中表现出良好的应用前景,但对抗体吸附的选择性认识仍不够充分。本文以商业化MEPHyperCel介质和实验室前期研发的3种新型MMC介质为典型介质,功能配基分别为4-巯基乙基吡啶(MEP)、2-巯基咪唑(MMI)、5-氨基苯并咪唑(ABI)、色氨酸-5氨基苯并咪唑(W-ABI),探讨不同类型和来源抗体的吸附性能,分析结合选择性,并考察分离性能。同时结合实验手段和生物信息学方法,分析MMC结合机制,为分离过程优化和新型配基设计提供指导。首先,以不同哺乳动物IgG以及人IgG的不同亚型为对象,比较Protein A和4种MMC介质对IgG的吸附特性。发现MMC介质对Protein A亲和力强及较弱的IgG均有较好吸附,且呈显著的pH依赖性,pH中性时吸附率高,酸性时吸附显著下降,不同种属和亚型略有差异。在pH3.0-4.0时,MEPHyperCel、MMI-4FF与ABI-4FF对大鼠IgG的吸附比小鼠和人IgG高10～30%;MMI-4FF对兔、牛、羊、驴 IgG 的吸附比 MEP HyperCel 和 ABI-4FF 低;MEP HyperCel、MMI-4FF和ABI-4FF对IgG3的吸附最小,对IgG2的吸附比IgG1高15～20%。其次,以几种常见禽类(鸡、鸭、火鸡、鸵鸟)抗体IgY为研究对象,发现Protein A吸附较弱,而MMC介质的吸附效果较好,且受pH影响明显。当pH 6.0～8.0 时,MEP HyperCel、MMI-4FF 和 ABI-4FF 介质对 IgY 吸附较高;pH 3.0～4.0时,吸附减少;W-ABI-4FF介质吸附IgY更倾向于酸性条件,pH3.0～6.0时吸附率最大,而pH 8.0～8.9时吸附率降低。选择ABI-4FF介质从免疫鸡血浆中分离IgY,优化后分离条件为上样pH7.0、洗脱pH4.5、上样量为5mL/介质(约含15 mg IgY),IgY收率为90.2%,纯度为94.6%,抗体生物活性完全保持。随后,以血液中另外两种重要抗体IgM和IgA为研究对象,发现Protein A无法吸附IgM和IgA,而MMC介质吸附良好,且受pH影响显著,趋势与IgG类似。与IgG不同的是,IgM和IgA达到较高吸附率的pH范围更宽。提出选择性指数SI,分析发现在pH 4.0～5.0时ABI-4FF和MMI-4FF对IgM/IgA和IgM/IgG的选择性较高,有利于IgM、IgA和IgG的分离。选择ABI-4FF介质,从杂交瘤细胞培养液分离IgM,一步分离纯度大于99%,收率为80.8%;采用ABI-4FF和MMI-4FF两步分离,从人血清中分离IgM,经过程优化,IgM纯度达到65.2%,纯化因子为28.3,且IgM生物活性能够得到保持。为了深入了解MMC介质结合IgG的机制,以IgG的Fab、Fc片段为研究对象,考察不同介质的吸附差异。在合适pH条件下,MEPHyperCel、W-ABI-4FF、MMI-4FF介质对IgG/Fc和Fab/Fc有较高的选择性。以混合蛋白为料液,考察MMC分离IgG和Fc,发现W-ABI-4FF介质效果最佳,上样pH 8.0,洗脱pH 3.6,流穿液中Fc的纯度大于90%,收率大于97%,洗脱液中IgG纯度大于97%,收率90%以上。ITC分析结果表明,MEP配基与IgG和Fab/Fc片段的结合主要由疏水作用驱动,配基与IgG存在多个结合结合位点,在中性条件下,结合可能在Fab也可在Fc片段;在碱性条件下,结合区域主要集中于Fab片段。为了从分子水平理解配基/蛋白的分子结构和宏观吸附特征之间的关系,以人IgG1、IgG4、IgG1-Fab、IgG1-Fc为典型对象,考察多种算法构建的定量构效关系(QSAR)模型。结果表明,基于支持向量机(SVM)算法的QSAR模型,可以用于表征不同pH条件下MEPHyperCel、ABI-4FF和MMI-4FF介质吸附抗体的定量关系,模型具有一定的稳定性和预测能力。三种介质的共同描述符为蛋白的静电和疏水特性。合并三种介质的关键描述符重新进行建模,得到的通用QSAR模型稳定性和预测能力均较好。通用描述符包括2个配基描述符(密度和电离相关)和5个蛋白描述符(静电势和疏水作用相关),表明配基与蛋白的电荷和疏水特性对MMC介质吸附至关重要。综上所述,本文从MMC介质的吸附特性出发,探讨了对不同来源和类型抗体的选择性和分离性能,并利用ITC、QSAR等手段探讨了 MMC介质抗体吸附的机制,相关结果有助于MMC分离新方法的应用,也为新型配基设计提供了一定思路。