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N-乙酰神经氨酸(N-Acetylneuraminic Acid, Neu5Ac)具有多样的生物学功能,其在治疗流感、神经性疾病、炎症和肿瘤等方面具有重要的医药价值,特别是在流感(包括禽流感H5N1和2009年的H1N1)的预防和治疗方面有良好的效果。Neu5Ac现有的生产方法产量低,成本高,难以满足医药工业大规模的需求,因而急需建立一种经济高效的生产方法。在Lin BX的前期研究中,构建了一株产Neu5Ac的代谢工程菌(E.coli AnanTEK/pNA),本研究通过对工程菌细胞培养和全细胞生物转化的各种条件的摸索,对工程菌生物转化生产Neu5Ac的过程进行优化。经过条件优化,建立了全细胞催化法生产Neu5Ac的小试工艺流程,使Neu5Ac的产量提高到294.39mM,该方法具有操作简便、高效和经济的优势,为Neu5Ac的规模化生产奠定了基础。在生产过程中发现部分丙酮酸用于细胞的新陈代谢,通过基因敲除技术敲除IdhA, poxB, aceE, plfB, meaB等基因,减弱丙酮酸的旁路代谢途径,使丙酮酸主要用于合成Neu5Ac,以确保获得Neu5Ac的高生产强度。经比较发现敲除IdhA和plfB基因的突变株对丙酮酸的旁路代谢途径有一定的减弱效果,但并不显著。采用P1噬菌体转染整合E.coli△plfB和E.coli△ldhA的性状,构建敲除株E.coli△BA。以0.2M丙酮酸和0.8M GlcNAc为底物进行生物转化,结果显示丙酮酸用于代谢旁路的量降低了24.96%,同时Neu5Ac的产量随之提高了7.11%。聚唾液酸(Polysialic acid, PSA)是唾液酸单体以a-2,8或a-2,9糖苷键连接而成的聚合物。聚唾液酸具备良好的非免疫原性,生物相容性和可降解性,是理想的药物缓释剂和医用支架材料。此外,聚唾液酸经水解可得到一系列的唾液酸类物质,这些衍生物多可应用于医药、食品和保健品等领域的高附加值产品。目前,微生物发酵是获得聚唾液酸的唯一生产方法。E.coli SA8自身可产生聚唾液酸,以E.coli SA8基因组为模板,克隆CMP-Neu5Ac合成酶,优化乙酰基转移酶和唾液酸转移酶基因的密码子,构建系列表达载体再转入E.coli SA9中进行过表达,以加强唾液酸到聚唾液酸这一合成途径。将经改造后的重组菌接入发酵培养基中进行摇瓶发酵,最高获得约0.97mg/mL的聚唾液酸,产量比出发菌株E.coli SA9提高了约150%,说明通过本方法可以达到加强PSA合成途径的目的,并证明了乙酰基转移酶为PSA合成途径中的限速酶。