应激调节肽CRF(corticotrophin-releasing factor，CRF)基因家族在动物环境适应与进化过程中起着重要作用，应激时，下丘脑分泌的CRF经垂体门脉进入垂体前叶与垂体促肾上腺皮质激素细胞膜上的CRFR1α(corticotrophin-releasing factortype1α receptor，CRFR1α)受体结合促使ACTH(adrenocorticotropic hormone，ACTH)释放，进而促进肾上腺皮质分泌皮质酮，调节机体一系列生理功能。生活在青藏高原的高原鼠兔(Ochotona curzoniae，Hodgson)、高原鼢鼠(Myospalaxbaileyi，Thomas)和根田鼠(Microtus oeconomus，Pallas)对高原低氧环境具有一套特殊的适应机制。我们实验室前期研究发现高原鼠兔、高原鼢鼠和根田鼠的HPA(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴对低氧应激呈低反应性，为了阐述是否这与它们的CRFR1α受体结构相关，我们以CRFRlα及其配体CRF和Ucn(Urocortin，Ucn)为研究对象，克隆了这三种高原动物CRFR1α、CRF和Ucn基因，研究了这些CRFR1α受体与CRF的亲和力、CRF和r/mUcn分别刺激这三种新受体产生的第二信使cAMP的变化以及调节水通道蛋白AQP4导致CHO细胞水肿的差异，并与平原动物大鼠、小鼠和大白兔进行了比较。主要研究结果如下：　　 ⑴克隆了高原鼠兔、高原鼢鼠、根田鼠和大白兔CRFR1α基因cDNA序列，编码区核苷酸序列全长均为1248bp，编码415aa的前体蛋白序列。克隆了高原鼠兔、高原鼢鼠和大白兔CRF成熟肽序列，核苷酸序列全长均为123bp，编码41aa的成熟肽。克隆了高原鼢鼠和根田鼠Ucn的cDNA序列，高原鼢鼠核苷酸序列长369bp，前体肽为122aa，根田鼠核苷酸序列长372bp，前体肽为123aa。它们的成熟肽均为40aa的蛋白序列。通过序列比对发现，CRF成熟肽序列高度保守，三种高原动物与GenBank上已知序列的大鼠、小鼠、大白兔、人、猫、狗和猪的完全相同。高原鼢鼠的Ucn成熟肽与GenBank上已知序列的大鼠、小鼠、牛和羊的完全一致，根田鼠有3个氨基酸不同。而三种高原动物CRFR1α存在多个变异位点并各具特点。与大鼠、小鼠、大白兔和人的相比高原鼠兔有8个独有的变异位点，高原鼢鼠有6个，根田鼠有5个独有的变异位点。这些变异位点在胞外区、跨膜区和胞内区均有分布。　　 ⑵分别构建了高原鼠兔、高原鼢鼠、根田鼠、大鼠、小鼠和大白兔的CRFR1α的真核表达载体，分别命名为oc-CRFR1、mb-CRFR1、mo-CRFR1、r-CRFR1、m-CRFR1和nr-CRFR1。分别将这六种CRFR1α真核表达载体瞬时转染CHO细胞，获得表达这六种CRFR1α的CHO细胞，分别命名为oc-CRFR1-CHO、mb-CRFR1-CHO、mo-CRFR1-CHO、r-CRFR1-CHO、m-CRFR1-CHO和nr-CRFR1-CHO。　　 ⑶分别提取了oc-CRFR1-CHO、mb-CRFR1-CHO、mo-CRFR1-CHO和m-CRFR1-CHO的粗膜片段，用放射性同位素125-I标记的CRF(Phonexipeptide，USA)进行了配体/受体亲和力的研究，结果表明CHO细胞中表达的三种高原动物CRFR1α膜蛋白与CRF配体结合的最大结合位点(Bmax)基本一致，高原鼠兔、高原鼢鼠、根田鼠和小鼠分别为1222fmol/mg pr、1224fmol/mg pr、1231fmol/mg pr和1225fmol/mg pr。发现高原鼠兔、高原鼢鼠、根田鼠和小鼠的CRFR1α受体平衡解离常数Kd值明显不同，分别为1617pM、1478pM、1509pM和1191pM。三种高原动物的Kd值均明显高于平原动物小鼠，其中以高原鼠兔最大、根田鼠次之、高原鼢鼠最小。说明高原动物CRFR1α受体的亲和力比平原动物小鼠的亲和力小。　　 ⑷在分别表达这六种CRFR1α的CHO细胞体系中用ELISA试剂盒(Cayman，USA)检测了CRF和r/mUcn分别刺激含这六种受体的CHO细胞产生的cAMP水平。发现CRF和r/mUcn配体刺激CHO细胞15分钟后，产生的cAMP水平呈剂量依赖相关性，但半数有效剂量(EC50)不同。CRF配体处理组，高原鼠兔、高原鼢鼠、根田鼠、小鼠、大白兔和大鼠的EC50值分别为8.354nM、6.431nM、6.250nM、4.226nM、3.701nM和3.530nM。最高的高原鼠兔的EC50值比最低的大鼠EC50值高2.4倍。r/mUcn配体处理组中，高原鼢鼠、根田鼠、高原鼠兔、大白兔、大鼠和小鼠的EC50值分别为20.36nM、13.00nM、4.310nM、3.046nM、2.239nM和1.601nM。最高的高原鼠兔的EC50值比最低的小鼠EC50值高12.7倍，根田鼠与小鼠差8倍，高原鼠兔与小鼠差2.6倍。在CRF或r/mUcn配体处理后，三种高原动物CRFR1α受体的EC50值均比三种平原对照动物的EC50值高。CRF配体产生cAMP的EC50值依高低顺序为高原鼠兔、高原鼢鼠、根田鼠。Ucn配体刺激产生的高低顺序为高原鼢鼠、根田鼠、高原鼠兔。提示这些差异是CRFR1α受体结构特性决定的。　　 ⑸构建了共表达高原鼠兔、高原鼢鼠、根田鼠和大鼠CRFR1α与大鼠水通道rAQP4的 CHO细胞系，分别命名为 oc-CRFR1/rAQP4-CHO、mb-CRFR1/rAQP4-CHO、mo-CRFR1/rAQP4-CHO和r-CRFR1/rAQP4-CHO。用CRF和r/mUcn分别孵育上述转染细胞，发现三种CRFR1α受体介导rAQP4蛋白参与细胞水通透性调节引起的CHO细胞水肿不同。CRF刺激oc-CRFR1/rAQP4-CHO、mb-CRFR1/rAQP4-CHO、mo-CRFR1/rAQP4-CHO和r-CRFR1/rAQP4-CHO细胞水肿程度没有显著差异。r/mUcn孵育后 oc-CRFR1/rAQP4-CHO、mb-CRFR1/rAQP4-CHO、mo-CRFR1/rAQP4-CHO细胞的水肿程度比大鼠r-CRFR1/rAQP4-CHO的轻，其中高原鼢鼠mb-CRFR1/rAQP4-CHO细胞水肿程度最轻，高原鼠兔、根田鼠与平原动物大鼠r-CRFR1/rAQP4-CHO的水肿没有明显差异，也提示这些差异与受体结构差异相关。　　 ⑹三种高原动物CRFR1α受体及根田鼠的Ucn配体序列存在不同程度的氨基酸突变，这些CRFR1α受体序列的不同导致它们与CRF配体结合的亲和力不同，诱导第二信使cAMP水平不同，以及通过下游靶效应器AQP4导致CHO细胞水肿程度也不同，这可能是CRFR1α受体结构差异性决定的，是三种高原动物HPA轴低反应性的部分机制。