背景与目的肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是世界成人最常见的恶性肿瘤之一,全球每年约有650,000患者罹患此病,如今肝癌已成为世界第三大癌症杀手。尽管有关肝癌的生物学特性以及发生发展机制研究较多,诊断技术的显著进步以及外科治疗水平的提高,肝癌患者的预后仍然不太理想,外科手术切除后5年复发率仍高达65%以上。因此,探索评估HCC复发、转移倾向的分子机制,对HCC的病程进展、预后评估有重要意义。近年来,多项研究表明,细胞凋亡抑制蛋白C-IAP2(cellular inhibitor of apoptotic protein-2)作为IAPs (inhibitor of apoptotic proteins)家族重要成员之一,广泛高表达于多种肿瘤细胞,与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移有密切关系。本研究采用荧光定量PCR、免疫荧光技术和VWestern Blot检测三种不同侵袭潜能的肝癌细胞株中C-IAP2mRNA和蛋白的表达情况,分析肝癌细胞株中C-IAP2mRNA和蛋白的表达同肝癌侵袭潜能的关系,并通过荧光定量PCR、免疫组化等技术检测原发性肝癌患者肝癌组织,癌边缘组织及非癌组织中C-IAP2mRNA和蛋白的表达情况,探讨C-IAP2mRNA和蛋白的表达与患者临床病理特征之间的关系,从组织水平分析C-IAP2的表达与HCC复发、转移之间的关系,为HCC的临床诊断、病程进展和预后评估提供新的线索。方法1、运用荧光定量PCR检测具有不同侵袭转移潜能的肝癌细胞株HepG2、SMMC7721、HCCLM3中C-IAP2mRNA的表达；并运用细胞免疫荧光技术和Western Blot检测上述三种细胞株C-IAP2蛋白的表达情况。分析C-IAP2的表达同肝癌细胞侵袭潜能之间的关系。2、收集南方医科大学南方医院肝胆外科2010年11月～2012年1月接受手术治疗的原发性肝癌患者的组织标本,标本均在离体2小时内取材固定,术后均经病理证实。3、运用荧光定量PCR检测72例肝癌患者的癌组织与非癌组织中C-IAP2mRNA的表达,以了解C-IAP2mRNA在肝癌组织与非癌组织的表达差异；并分析肝癌组织中C-IAP2mRNA的表达和临床病理特征之间的关系。4、运用免疫组化技术检测75例肝癌患者的癌组织、癌边缘组织以及对应的非癌组织中的C-IAP2蛋白的表达,以了解C-IAP2蛋白在癌组织、癌边缘组织及对应的非癌组织的表达差异,进一步分析癌组织中的C-IAP2蛋白表达与临床病理特征的关系。5、统计学处理：应用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学处理,C-IAP2在肝癌组织、癌边缘组织和非癌组织中蛋白阳性表达率的比较以及不同临床病理特征情况下C-IAP2在肝癌组织中的阳性表达率的比较均采用Pearson Chi-Square检验。肝癌组织中C-IAP2mRNA和蛋白不同表达强度的复发的比较采用生存分析(Kaplan-Meier曲线,log-rank法)。荧光定量PCR的实验数据采用2-△△CT进行处理,每个样本重复实验进行3次实验,计算各样本平均CT (threshold cyclenumber)值和△CT值(△CT=CT C-1AP2-CTGAPDH),计算2-△△Ct(CT=CT目的-CT(?)),其数值表示目的表达值相对于对照表达值的相对倍数,计量资料以X±SD表示。癌组织与对应非癌组织间C-IAP2mRNA的表达的比较采用配对t检验,C-IAP2mRNA的表达与临床病理参数之间的比较采用两独立样本t检验、方差分析、LSD-t检验,三种不同侵袭潜能肝癌细胞株C-IAP2mRNA和蛋白的比较均采用方差分析和LSD-t检验,检验水准α=0.05,采用双侧性检验。结果1、荧光定量PCR结果显示C-IAP2mRNA在三种不同侵袭潜能细胞株中均有表达,侵袭转移潜能最强的HCCLM3表达最高,SMMC7721次之,无侵袭转移潜能的HepG2表达最低,HCCLM3的表达量为HepG2的54.95倍,SMMC7721的表达量为HepG2的12.13倍,差异有统计学意义(P<0.05)。2、Western Blot检测三种不同侵袭潜能肝癌细胞株C-IAP2蛋白的表达水平,侵袭转移潜能最强的HCCLM3表达最高(9.109±0.632), SMMC7721次之(2.689±0.637),无侵袭转移潜能的HepG2表达最低(0.297±0.556),差异有统计学意义(F=348.001；P<0.001)。3、细胞免疫荧光结果显示每种细胞株胞浆和胞核内都可见不同程度阳性染色,C-IAP2在高侵袭潜能细胞株HCCLM3的胞浆和胞核均呈强阳性表达,而C-IAP2在HepG2、SMMC7721胞核和胞浆中均呈弱阳性表达,C-IAP2在三种细胞株中的表达情况为：HCCLM3> SMMC7721>HepG2。4、72例肝癌患者肝癌组织中C-IAP2mRNA的表达量较对应的非癌组织明显升高,癌组织中的表达量为非癌组织的2.70倍,差异有统计学意义(P<0.001)。5、C-IAP2mRNA在肝癌组织中的表达与患者术前有无癌栓、有无淋巴结转移、AFP水平、肿瘤病理分化类型、TNM分期以及预后有关(P<0.05),术前有癌栓的C-IAP2mRNA表达量为无癌栓的9.65倍,有淋巴结转移的为无淋巴结转移的6.53倍,AFP≥400ug/L的为AFP<400ug/L的2.79倍,TNM分期中Ⅲ-Ⅳ期的表达量为Ⅰ-Ⅱ期的6.63倍,病理分化类型经方差分析和LSD-t检验,发现中分化和低分化者均较高分化者表达量高,而中、低分化之间无差异,C-IAP2mRNA高表达组的术后复发率比低表达组术后复发率高。C-IAP2mRNA在肝癌组织中的表达与患者性别、年龄、乙型肝炎表面抗原、肿瘤大小、肿瘤数目、肝硬化以及包膜完整性无关。6、免疫组化显示肝癌组织、癌边缘组织及对应非癌组织的细胞浆内均有C-IAP2蛋白表达。C-IAP2蛋白在癌边缘组织、癌组织以及非癌组织的阳性表达率分别为86.7%,69.3%和26.7%(χ2=60.057,P<0.001)。7、肝癌组织中C-IAP2蛋白阳性表达率与肿瘤分化程度,TNM分期,AFP水平,淋巴结转移,癌栓以及预后有关(P<0.05), C-IAP2阳性表达率随着分化程度的降低而升高,TNM分期中Ⅲ-Ⅳ期的阳性表达率较Ⅰ-Ⅱ期高,AFP≥400ug/L的患者较AFP<400ug/L的患者阳性表达率高,术前有癌栓的患者较无癌栓者阳性表达率高,有淋巴结转移者较无淋巴结转移者阳性表达率高,C-IAP2阳性高表达组术后复发率最高,低表达组次之,阴性表达组最低。而与患者性别、年龄、乙型肝炎表面抗原、肿瘤大小、肿瘤数目、肝硬化、包膜是否完整无关(P>0.05)。结论1、C-IAP2mRNA和蛋白在三种不同侵袭潜能肝癌细胞株中均有表达,侵袭转移潜能最强的HCCLM3表达最高,SMMC7721次之,无侵袭转移潜能的HepG2表达最低,C-IAP2mRNA和蛋白的表达同肝癌细胞的侵袭转移潜能密切相关。2、肝癌组织中C-IAP2mRNA的表达量较对应的非癌组织明显升高,C-IAP2蛋白在癌边缘组织阳性表达率最高,癌组织次之,非癌组织最低。C-IAP2mRNA和蛋白在肝癌组织中的表达与患者术前有无癌栓、有无淋巴结转移、肿瘤病理分化类型、甲胎蛋白水平、TNM分期以及预后有关,而与患者其他临床特征无关,这表明C-IAP2的表达水平可能影响原发性肝癌的肿瘤生物学特性。3、三种不同侵袭转移潜能肝癌细胞株中C-IAP2mRNA和C-IAP2蛋白的表达随着肝癌细胞株侵袭潜能的增加而增加；另外,肝癌组织中C-IAP2mRNA和C-IAP2蛋白的表达均较非癌组织高,且在肝癌组织中的表达同肿瘤分化类型以及患者的预后密切相关。这就表明C-IAP2可能和HCC的发生发展、预后密切相关,有望成为判断肝癌预后的新生物学指标或治疗肝癌的潜在靶点。