卵巢癌(ovarian cancer,OC)是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,发病率位于宫颈癌与子宫内膜癌之后,排名第三[1-3],其中上皮性肿瘤占原发性卵巢肿瘤的50%~70%,而恶性类型占卵巢癌的85%~90%[4]。多数卵巢癌病人由于早期缺乏明显的临床症状和高效的筛查技术,在发现时已为时已晚,并且期别也很高,也就促成了卵巢癌的治疗难度大、复发率高,5年生存率非常低的严峻形势[5]。CD147,又名EMMPRIN或Basigin,是一个高度糖基化的跨膜蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员[6-9]。CD147通过诱导基质金属蛋白酶(MMPs)分泌降解细胞外基质或通过上调VEGF表达、抑制凋亡等多种途径促进肿瘤侵袭转移[10-12]。CD147的高表达与卵巢癌的不良预后息息相关[13],作为一种重要的肿瘤标志物,阐明其表达调控机制对卵巢癌的诊断及治疗具有重要意义。孔等[14]的研究发现转录因子Sp1能直接与CD147启动子区特异结合并能有效启动其转录表达。此外,他们还发现CD147的低甲基化可以增加其与Sp1蛋白的亲和力,从而上调CD147表达。研究报道提示Sp1蛋白的磷酸化形式对于Sp1介导的基因转录激活作用具有重要意义[15]。Sp1的磷酸化形式或可增加其与DNA的结合能力,或可增加其蛋白的稳定性,或可影响它的转录活性。Tan等发现管紧张素Ⅱ激活PKC通路使Sp1的锌指结构域(Thr668,Ser670和Thr681位点)磷酸化,磷酸化后的Sp1与血小板衍生因子-D启动子的结合能力增加[16]。阻断JNK信号通路导致的Sp1在Thr278和Thr739位点的磷酸化,可以导致sp1的苏木素化,加速降解[17,18]。由于sp1的转录活性受到其与启动子的结合能力,蛋白的合成,核酸转运能力,与其它蛋白的相互作用以及蛋白的稳定性等多种因素影响,很难判断sp1的磷酸化对cd147转录活性的影响。本课题的研究目标有四点:首先明确sp1磷酸化是否参与cd147基因调控,其次探讨其具体调控机制[19],再次分析sp1磷酸化与cd147基因的相互作用对卵巢癌侵袭性的影响,最后分别在卵巢癌细胞及组织中分析sp1磷酸化与cd147表达的相关性[20]。第一部分:明确sp1磷酸化参与cd147基因表达调控。我们运用基因定点突变的方法构建了6个sp1磷酸化位点的突变体(thr355,thr453,th668,ser670,thr681,thr739)[21,22],将特定位点的丝?苏氨酸突变成谷氨酸,使其失去被磷酸化激活的功能。之后通过瞬时转染突变体和cd147启动子检测萤火虫荧光素酶强度发现sp1在thr453和thr739两个位点的突变可以显著降低sp1对cd147基因表达上调的作用[23]。在随后的实时定量pcr和westernblot的实验中也得到了验证。第二部分:探讨sp1磷酸化调控cd147基因表达机制。为了探讨sp1磷酸化参与cd147基因表达调控的具体机制,我们运用pi3k/akt和mapk/erk磷酸化通路特定抑制剂ly294002、雷帕霉素和pd98059预处理卵巢癌细胞后发现[24],sp1在thr453和thr739两个位点的磷酸化水平会随之下降,而总蛋白未见明显变化。此外,我们还发现cd147的蛋白水平也随之下降,提示通过pi3k/akt/mtor和mapk/erk途径可以激活sp1的磷酸化,而当sp1磷酸化水平受抑制时,cd147的表达水平也下降,提示sp1磷酸化对sp1激活cd147基因转录具有激活作用。而当我们上调或下调cd147的表达后,发现pakt,p70s6k和perk以及sp1在thr453和thr739两个位点的磷酸化水平均下降,而总蛋白均未见明显变化。综合第一部分实验,我们得知sp1在thr453和thr739位点的磷酸化可以增强sp1对cd147基因的转录激活作用,而在skov3细胞中过表达cd147基因后,sp1在thr453和thr739位点的磷酸化表达增加[25]。这是由于上游的pi3k/akt/mtor和mapk/erk通路被活化造成的。cd147-sp1关系环构成的正反馈环路可能成为解释cd147差异性表达的原因之一。第三部分:检测sp1磷酸化与cd147基因表达的相互作用对卵巢癌侵袭性的影响。用sp1(在thr453和thr739位点)磷酸化抗体和cd147单抗单独或联合封闭卵巢癌HO-8910细胞系的高转移株,Transwell实验发现卵巢癌细胞的侵袭性降低,提示Sp1-CD147关系环可以增加卵巢癌的侵袭性。第四部分:检测Sp1磷酸化与CD147基因在卵巢癌细胞及组织中的表达并分析其相关性。我们运用Western blot方法检测卵巢癌细胞株SKOV3、HO-8910和HO-8910PM中p-Sp1(Thr453)、p-Sp1(Thr739)和CD147的表达。结果显示在卵巢癌细胞中Sp1磷酸化蛋白水平和CD147蛋白在三种细胞系中的表达高低具有一致性。之后我们运用免疫组化的方法检测了53例卵巢癌标本中的p-Sp1(Thr453)、p-Sp1(Thr739)和CD147的表达和分布。结果显示Sp1的磷酸化蛋白主要表达于卵巢癌的细胞核膜和核内,而CD147主要表达于细胞膜和细胞浆中。CD147的表达情况统计结果示12例(强阳性,22.64%);15例(阳性,28.30%);6例(弱阳性,11.32%);20例(阴性,37.74%)Phospho-Sp1(T453)的表达情况统计结果示24例(强阳性,45.28%);13例(阳性,24.53%);7例(弱阳性,13.21%);9例(阴性,16.98%)而phospho-Sp1(T739)的表达情况统计结果示16例(强阳性,30.19%),14例(阳性,26.42%),10例(弱阳性,18.87%);13例(阴性,24.53%)。CD147阳性结果所占比例为62.26%,而phospho-Sp1(T453)和phospho-Sp1(T739)的阳性表达率分别为83.02%,75.47%。Spearman秩相关分析显示p-Sp1(Thr453)、p-Sp1(Thr739)和CD147的表达低度相关(rT453=0.477,P<0.01;rT739=0.461,P<0.01)。根据上述结果,我们明确了转录因子Sp1的磷酸化修饰与CD147基因表达的相互作用,并且发现Sp1-CD147正反馈关系环能促进卵巢癌细胞的侵袭性。这些结果有助于我们进一步了解卵巢癌中CD147基因高表达的发生机制,提示通过破坏Sp1-CD147正反馈关系环有助于卵巢癌的治疗。