透明质酸（ hyaluronic acid，HA）是一种高分子多糖，是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的必需组分。透明质酸酶（hyaluronidase，HAase）是特异性降解HA的酶家族，广泛存在于微生物和动物组织中。HAase通过催化HA水解，降低HA黏度，可逆性地改变真皮结构，从而提高组织通透性。因此，HAase已被用于提高与其联用的其他药物、药剂和蛋白质在组织间的分散和传递效率。　　已进入临床应用的HAase主要有两类，一类提取自哺乳动物睾丸组织，一类是利用基因重组技术将人精子膜蛋白PH20在哺乳动物细胞中表达、纯化制成的重组人透明质酸酶（recombinant human hyaluronidase，rHuPH20）。　　透明质酸酶PH20有六个糖基化位点和五个二硫键，难以高效表达和规模化生产。本实验室具备哺乳动物细胞规模化培养能力，使用生物反应器进行了若干次5L规模的细胞培养，探索rHuPH20培养和纯化工艺。本研究的目的是进行rHuPH20的工艺优化，建立适用于规模化制备的纯化工艺，确定rHuPH20的质量标准，使其符合《中国药典》要求。　　首先，在文献调研的基础上设计纯化工艺，得到纯度＞90％的目的蛋白。为了进一步提高蛋白纯度和收率，从以下几个方面进行了工艺优化：　　（1）考虑到规模化生产的需要，引进中空纤维柱处理发酵液，在不影响酶活性的前提下提高了处理效率；　　（2）由于高流速季铵琼脂糖凝胶柱（Q Sepharose fast flow，Q FF）填料可承受的流速比高载量季铵琼脂糖凝胶柱（Q Sepharose XL，Q XL）填料高，为了在粗纯阶段对样品进行快速处理，改进了Q柱层析的填料。由于Tris缓冲液在pH7.0时的缓冲能力比HEPES缓冲液低，为了保证目的蛋白所带电荷在纯化过程中不会因为pH值改变发生歧化反应，改进了Q柱层析的缓冲液。最后，采用阶梯梯度洗脱法优化洗脱条件，提高了纯化效果。　　（3）初次制备时，高效苯基交联琼脂糖凝胶柱（Phenyl high performance，Phenyl HP）层析的纯化方式为流穿，不利于控制蛋白纯化过程。高盐浓度有利于蛋白质与吸附剂结合，但高盐可能改变酶的空间结构，使酶永久性失活。因此，先进行了(NH4)2SO4浓度耐受实验，根据实验结果，提高了(NH4)2SO4浓度，成功将目的蛋白结合在层析柱上。然后，采用阶梯梯度洗脱法优化洗脱条件，提高了纯化效果；　　（4）由于陶瓷羟基磷灰石Ⅱ型（ceramic hydroxyapatite typeⅡ，CHTⅡ）层析柱对蛋白的吸附能力比Ⅰ型层析柱弱，蛋白表达量的提高，可能超出Ⅱ型层析柱的吸附能力；另外，目的蛋白等电点（isoelectric point，pI）理论值为5.6，是一种酸性蛋白，Ⅰ型层析柱更适宜酸性蛋白纯化，因此改用Ⅰ型层析柱进行后续实验。由于CHT柱填料羟基磷灰石会在层析过程中溶解，使层析柱失效，而磷酸盐与少量钙离子联用，可充分抑制其溶解，因此，在磷酸盐缓冲液中加入少量CaCl2抑制羟基磷灰石溶解，延长了层析柱使用寿命。为了避免由于无水磷酸盐和水合磷酸盐混用导致溶液中焦磷酸盐含量不一致对层析过程的影响，统一了用于缓冲液配置的高阶磷酸盐水平。通过降低上样溶液电导率，使目的蛋白与层析柱完全结合。最后，采用阶梯梯度洗脱法优化洗脱条件，提高了纯化效果；　　（5）由于高流速磺酸基琼脂糖凝胶柱（SP Sepharose fast flow，SP FF）填料主要用于粗分离和中度纯化阶段，不适宜作为柱层析的最后一步，因此，改用适用于精细纯化的高效磺酸基琼脂糖凝胶柱（SP Sepharose high performance，SP HP）。用阶梯梯度洗脱实验优化了实验步骤，提高了纯化效果。　　通过以上系统性实验建立了简便易行的层析工艺，得到的目的蛋白纯度＞99.9%，N-端测序结果表明，目的蛋白N端氨基酸序列与理论序列一致。　　在此基础上，对生产工艺进行了放大，能够满足原液和成品质量研究的需求。　　在制备工艺确立的基础上，根据《中国药典》（2015版）Ⅲ部对重组生物制品的相关要求进行了目的蛋白结构确证和原液质量标准研究。主要内容包括：纯度、质谱相对分子质量（脱糖/非脱糖）、氨基酸序列覆盖率、二硫键分析、活性、蛋白含量、比活性、宿主细胞蛋白质残留、外源DNA残留、等电点和蛋白N端序列等。　　结果显示：　　（1）质谱相对分子质量、二硫键配对信息、等电点和N-端氨基酸序列与理论值一致；　　（2）氨基酸序列覆盖率、SDS-PAGE纯度、SEC-HPLC纯度、HIC-HPLC纯度、宿主细胞蛋白残留和外源DNA残留符合《中国药典》标准；　　本部分的研究成果还包括：　　（1）建立了利用SEC-HPLC法检测rHuPH20纯度的方法，并对方法的专属性、线性、重复性、中间精密度、检测限、定量限和耐用性进行了评估；　　（2）优化了透明质酸酶活性检测方法。在活性检测中，使用牛血清白蛋白（BSA）与HA反应，解决了药典方法使用动物血清带来的批间差异问题，也解决了实验室条件下冻干水解明胶难以制备的难题，优化并建立了适用于全程跟踪酶活性的HAase活性测定方法。　　综上所述，本研究确立了可用于rHuPH20规模化制备的纯化工艺，并通过一系列质量研究确定了该工艺条件下的制品符合重组蛋白药品申报临床试验的要求。