第一部分不同径路重组腺相关病毒在耳蜗细胞中的转染效率　　目的:使用重组腺相关病毒作为基因转染载体，分别通过耳蜗鼓阶切开途径、胶原酶处理后经圆窗膜径路、耳蜗中阶切开途径将病毒投放到内耳，比较不同径路的可靠性及安全性，为内耳功能性基因转染提供现实依据。　　方法:选取经闭合声场听性脑干反应测试正常的Dunkin-Hartley豚鼠18只。按照不同的耳蜗给药途径分为三组:耳蜗鼓阶切开途径（A组）、胶原酶处理后经圆窗膜径路组（B组）、耳蜗中阶切开途径（C组）。每组6只动物，随机选择单侧耳注射携带绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒(AAV-GFP，滴度3E^12PFU/mL)，对侧耳采用相同的方法注射生理盐水。术后两周测试双耳听性脑干反应，处死动物，并取出双侧耳蜗基底膜。采用免疫荧光技术进行染色，计算手术侧毛细胞转染效率及毛细胞损失情况，并观察对侧毛细胞是否存在损伤及转染情况。　　结果:A组及B组的豚鼠术后两周闭合声场听性脑干反应显示左右耳阈值与术前无明显差别。转染表达产物的荧光信号主要分布在内毛细胞，A组豚鼠在内毛细胞转染效率是34％，外毛细胞3.6％;B组豚鼠内毛细胞转染效率为26％，外毛细胞1.2％;A组豚鼠内毛细胞的转染效率略高于B组。C组豚鼠，术后闭合声场听性脑干反应出现较明显阈移，以4kHz最为明显，内毛细胞转染效率25％，外毛细胞转染效率3.7％。可见外毛细胞损伤，且以第二回最为明显。三组动物均未见对侧耳蜗毛细胞损伤及转染。　　结论:经耳蜗鼓阶切开途径、胶原酶处理后经圆窗膜径路、耳蜗中阶切开途径均可将病毒注射到内耳，并成功转染毛细胞。但是，在内外毛细胞中的转染效率偏低。耳蜗中阶切开途径可造成听功能的损伤及毛细胞的损失，因此，在耳蜗局部基因转染中的作用有限。　　第二部分重组腺相关病毒滴度对转染效率的影响　　目的:比较不同滴度的表面酪氨酸残基敲除的重组腺相关病毒载体在耳蜗毛细胞中的转染效率。　　方法:选取经闭合声场听性脑干反应测试正常的Dunkin-Hartley豚鼠24只，按照使用病毒的情况不同随机分为三组:A组:投放重组腺相关病毒(AAV-GFP，滴度4E^12PFU/mL);B组:投放表面酪氨酸残基敲除的重组腺相关病毒(mutant-AAV-GFP，滴度3E^12PFU/mL);C组:投放高滴度变异腺相关病毒(mutant-AAV-GFP，滴度7E^13PFU/mL)。多有动物均经耳蜗鼓阶切开途径投放病毒。每只动物单侧耳投放病毒5μL。手术后两周测试双耳闭合声场听性脑干反应，处死动物后取双侧耳蜗基底膜，采用免疫荧光技术染色计算手术侧毛细胞转染效率及毛细胞损失情况，并观察对侧毛细胞的转染情况。　　结果:术后两周闭合声场听性脑干反应显示，左右耳阈值与术前无明显差别。三组豚鼠的毛细胞转染效率存在显著差异。其中，C组豚鼠的内、外毛细胞显示出很高的转染效率，内毛细胞平均转染效率为82％，外毛细胞为46％，部分动物的球囊毛细胞也可见转染;B组豚鼠的毛细胞转染效率稍低，内毛细胞平均转染效率为44％，外毛细胞为8％;而A组豚鼠的毛细胞转染效率最低，转染的毛细胞主要集中在底回，而顶回几乎没有转染。内毛细胞平均转染效率33％，外毛细胞3％。所有实验动物未见明显毛细胞损伤;对侧耳毛细胞未见转染信号。　　结论:高滴度的变异腺相关病毒在耳蜗毛细胞转染中具有极大的优势。病毒滴度的提高及病毒表面酪氨酸残基的敲除提高了其在毛细胞中，特别是外毛细胞中的转染效率。且该病毒对听功能及毛细胞无明显损害，是目前基因转染优先选择的载体。　　第三部分腺相关病毒在新生小鼠耳蜗中的转染　　目的:使用变异的腺相关病毒在新生小鼠的耳蜗进行转染，探索使用基因转染来治疗遗传性聋的可行性。　　方法:选用C57BL-6J小鼠（出生后7天）48只，分别使用经圆窗膜穿刺和胶原酶处理圆窗膜后渗透两种方式进行腺相关病毒耳蜗基因转染。在胶原酶处理组中，分别使用不同浓度的胶原酶30mg/mL，60mg/mL，90mg/mL。比较经圆窗膜穿刺和胶原酶处理圆窗膜后渗透两种方式的听功能损伤情况及耳蜗细胞的转染情况。　　结果:90mg/mL胶原酶处理新生小鼠圆窗膜后，可导致明显的听功能损伤。使用30mg/mL胶原酶处理圆窗膜后，尽管没有听功能损伤，但是经该途径的腺相关病毒转染不成功。使用60mg/mL胶原酶处理圆窗膜后，没有听功能损伤，可在内外毛细胞(IHC:47％，OHC:17％)及其他耳蜗细胞中可以看到转染信号。经圆窗膜穿刺途径注射病毒，也没有观察到明显的听功能损失，在耳蜗内外毛细胞(IHC:58％，OHC:19％)及其他耳蜗细胞中也可看到转染。　　结论:通过经圆窗膜穿刺途径和60mg/mL胶原酶处理圆窗膜后渗透途径，成功地实现了在新生小鼠耳蜗的局部基因转染，为使用基因转染治疗遗传性聋奠定了基础。　　第四部分重组腺相关病毒携带X连锁凋亡抑制蛋白基因对抗顺铂的耳毒性　　（一）速尿-顺铂联合作用建立耳毒性模型　　目的:探讨使用速尿-顺铂联合作用建立耳毒性模型，并与顺铂连续注射比较听功能、毛细胞损失的程度以及动物的死亡率　　方法:选取健康豚鼠48只，并进行开放声场ABR测试。按照注射顺铂的剂量不同豚鼠随机分为四组:A组，200mg/kg速尿注射后，给予0.1mg/kg顺铂;B组，200mg/kg速尿注射后，给予0.2mg/kg顺铂;C组，200mg/kg速尿注射后，给予2mg/kg顺铂;D组，3mg/kg顺铂连续注射5天。耳毒性药物完成注射后一周，再次测试动物的开放声场ABR，并处死动物，使用荧光染色技术观察毛细胞的损伤情况。　　结果:速尿-顺铂联合作用可导致动物出现不同程度的听功能损伤。200mg/kg速尿与0.1mg/kg、0.2mg/kg、2mg/kg的顺铂联合使用分别造成了11.6％、45.6％、97.7％的外毛细胞损伤。顺铂连续注射所造成的动物死亡率为45％，而使用速尿-顺铂联合作用造成的动物死亡率为14％。后者明显低于前者。　　结论:速尿-顺铂联合作用能够高效地造成听功能及外毛细胞损失，这种耳毒性模型的动物死亡率大大地低于顺铂连续注射造成的动物死亡率。　　（二）经圆窗膜途径注射顺铂建立耳毒性模型　　目的:探讨使用经圆窗膜注射顺铂建立耳毒性模型，评估这种耳毒性模型的听功能、毛细胞损失的程度以及动物的死亡率　　方法:选取健康豚鼠24只，并进行双耳闭合声场ABR测试。按照注射顺铂的剂量不同豚鼠随机分为三组:A组，0.125mg/mL顺铂5μL;B组，0.25mg/mL顺铂5μL;C组，0.5mg/mL顺铂5μL。耳毒性药物完成注射后一周，再次测试动物的闭合声场声场ABR，并处死动物，使用荧光染色技术观察毛细胞的损伤情况。　　结果:经圆窗膜注射顺铂可导致动物出现不同程度的听功能损伤。0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL顺铂5μL经圆窗膜注射分别造成了0.1％、13％、60％的外毛细胞损伤。该耳毒性模型的动物死亡率为10％。　　结论:经圆窗膜注射顺铂能够高效地造成听功能及外毛细胞损失，这种耳毒性模型的动物死亡率大大地低于顺铂连续注射造成的动物死亡率。　　（三）重组腺相关病毒携带X连锁凋亡抑制蛋白基因对抗顺铂的耳毒性　　目的:探讨使用重组腺相关病毒作为基因载体，携带X连锁凋亡抑制蛋白基因(X-linkedinhibitorofapoptosisprotein，XIAP)进行耳蜗局部基因转染来对抗顺铂介导的毛细胞死亡的可行性。　　方法;选取健康豚鼠36只，将mutant-AAV-XIAP(滴度4E^13PFU/mL)经耳蜗鼓阶切开途径投放到成年豚鼠的任意一侧耳蜗，对侧为对照耳，注射生理盐水，所有试验动物于手术后两周分别测试双耳闭合声场听性脑干反应，然后给予速尿-顺铂联合注射，破坏外毛细胞。分别于耳毒性药物注射后12小时、3天及7天，测试实验动物双耳闭合声场听性脑干反应。听力学测试完成后处死动物，行基底膜铺片，使用荧光染色技术观察毛细胞的损伤及局部凋亡产物的表达情况。　　结果:术后两周，豚鼠双耳的闭合声场听性脑干反应阈值无明显差异。在耳毒性药物注射后12小时、3天及7天，双耳闭合声场听性脑干反应的阈值均上升，双耳在各频率的阈移没有明显差异。在耳毒性药物注射后12小时，即可观察到外毛细胞损伤及凋亡产物，双耳的外毛细胞损失量有明显差异，注射病毒侧耳蜗基底膜中的凋亡产物信号明显少于注射生理盐水侧耳蜗的基底膜中的荧光信号。在耳毒性药物注射后3天，双侧耳蜗基底膜上凋亡产物的量及外毛细胞损失量无明显差异。耳毒性药物注射后7天后，双侧耳蜗外毛细胞损失没有明显差别。　　结论:通过耳蜗局部投放重组腺相关病毒搭载X连锁凋亡抑制蛋白基因，能够在顺铂损伤耳蜗外毛细胞的早期发挥作用，通过抑制凋亡减轻外毛细胞的损伤。但是，这种对外毛细胞的保护作用并不能持续较长时间。单纯凋亡抑制似乎不能有效对抗顺铂导致的毛细胞死亡。