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尽管白血病的治疗取得了值得肯定的进步,但是仍有10%-40%的BCR-ABL阴性的急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）患者无法取得完全缓解（complete remission,CR）。不少患者在治疗过程中复发或者在CR后很快复发,最终演变成难治性白血病,治愈的可能性极低。在BCR-ABL阴性的ALL中约有30%的成人和10%-15%的儿童为急性T淋巴细胞白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL）。T-ALL的长期预后不佳,5年的总生存率（overall survival,OS）约为50%。影响白血病疗效的因素众多,其中白血病细胞出现的化疗药物耐药导致的白血病治疗失败是主要原因。研究发现,许多因素参与细胞对化疗药物的耐药过程,如基因变异、ABC转运蛋白的过表达、骨髓微环境的变化以及Micro RNA的调控。核仁素（Nucleolin,NCL,C23）,是一种参与细胞多种生命活动的多功能蛋白,由三个独立的结构域组成,可以分别结合DNA、RNA和蛋白质,发挥相应的功能。核仁素是一种穿梭蛋白,分布于细胞的不同部位,包括细胞膜、细胞质和细胞核,参与核糖体合成,mRNA转运、细胞信号转导。目前有报道核仁素在增殖旺盛的细胞中包括多种肿瘤细胞如胃癌、白血病、宫颈癌及肺细胞表达水平增高。在本课题组的前期研究结果中,核仁素在耐药白血病细胞株和复发难治白血病患者的原始细胞中表达量增高。DIGE（Difference gel electrophoresis）技术分析显示NCL和核仁磷酸蛋白（Nucleophosmin,NPM）在耐药急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia,AML）细胞株HL-60/ADR中较其亲本细胞株HL-60显著增高。对临床标本的研究结果发现NCL和NPM在复发难治的急性白血病患者中表达水平上调,水平的上调与患者的不良预后相关。此外,我们也在9种血液系统恶性肿瘤细胞株中验证了这两种蛋白的表达,包括HL-60/ADR、KG/01和K562/ADR。根据以上结果,我们推测NCL与白血病细胞的耐药表现有关。目前关于NCL的表达上调和白血病耐药的关系的研究较少,在本研究中,我们构建了NCL基因过表达和沉默的T-ALL细胞株,探讨NCL对白血病耐药的影响。方法1.收集初治ALL患者临床标本,检测NCL蛋白表达情况。比较NCL的表达水平对CR率、复发率、OS、无复发生存率（relapse free survival,RFS）的影响,并进行COX分析。2.设计并构建靶向NCL mRNA的shRNA载体和NCL过表达载体,包装成慢病毒,使用NCL过表达和RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒转染Jurkat细胞,Molt-4细胞则转染NCL过表达慢病毒。检测转染效率以及NCL基因过表达或干扰效率。3.绘制细胞生长曲线、进行细胞克隆形成实验、检测细胞周期变化和细胞凋亡现象以检测NCL过表达和沉默对细胞增殖能力的影响。4.利用IC50实验、阿霉素（adriamycin,ADM）药物蓄积实验和罗丹明123（Rhodamine123,Rho123）外排实验检测转染后细胞药物敏感性的变化。5.采用qRT PCR和western blot实验检测NCL过表达或沉默后细胞内凋亡和耐药相关分子的变化。6.检测细胞相关信号通路的变化。7.进行回复实验确认RNA干扰的特异性,排除脱靶效应,包括构建NCL回复突变表达慢病毒,以及检测转染后的细胞的NCL回复表达效果和BCRP表达回复效果。7.使用免疫共沉淀实验检测NCL与其他蛋白的相互作用,进行ERK通路抑制实验探讨NCL的调控机制。结果1.相对于阴性组,NCL阳性表达组的CR率低,复发率高。NCL阳性表达的初治ALL患者OS、RFS更差。NCL是ALL不良预后的独立危险因素。2.成功构建了NCL过表达和RNAi的慢病毒载体,滴度分别为2.50E+08 TU/ml和3.00E+08 TU/ml.NCL过表达慢病毒载体（LV-NCL-OE）转染Jurkat和Molt-4细胞的NCL基因表达分别上调了3.40±0.08和2.48±0.13倍。NCL RNAi慢病毒载体（LV-NCL-RNAi）转染Jurkat细胞NCL基因表达抑制率超过70%。3.Jurkat细胞和Molt-4细胞的生长曲线和细胞克隆形成实验的结果显示NCL基因过表达后细胞的增殖能力明显上调。NCL基因沉默后,Jurkat细胞的生长曲线和克隆形成实验显示细胞的增殖能力受到明显的抑制,细胞凋亡增加,出现G2M期阻滞。4.NCL基因过表达后,Jurkat和Molt-4细胞的对阿霉素的耐药性升高,Jurkat/OE细胞对阿霉素的IC50为1.362±0.271μg/ml,相对于Jurkat/ONC组IC50升高了8.42倍。Molt-4/OE细胞对阿霉素的IC50为2.821±0.733μg/ml,相对于Molt-4/ONC组升高了6.60倍。Jurkat/OE和Molt-4/OE的药物蓄积减少,外排增加。NCL基因沉默后,Jurkat细胞对阿霉素的耐药性下降,Jurkat/KD细胞对阿霉素的IC50为0.077±0.010μg/ml,相对于Jurkat/Scr组下降了2.32倍。KD细胞的药物蓄积增加,外排减少。5.NCL基因过表达后,细胞的Bcl-2、c-Myc、BCRP、LRP、MRP1等抑制凋亡分子和耐药相关分子表达上调,ERK通路活化增加。NCL基因沉默后,细胞的Bcl-2、c-Myc、BCRP、LRP、MRP1表达下调,ERK活化受到抑制。6.回复实验结果显示KD细胞的NCL和BCRP的表达得到部分回复。7.NCL与BCRP、MRP1、Ras、ERK存在相互作用。抑制Raf、MEK1/2、ERK,可以抑制BCRP、MRP1的表达和功能,不影响NCL的表达。结论1.NCL与ALL的不良预后相关,是影响ALL预后的独立危险因素。2.NCL过表达促进细胞增殖和耐药性,上调Bcl-2、c-Myc和BCRP、LRP、MRP1的表达,并且活化ERK通路。NCL沉默抑制细胞增殖和耐药性,下调Bcl-2、c-Myc和BCRP、LRP、MRP1的表达,抑制ERK通路活化。3.NCL蛋白与BCRP、MRP1、Ras、ERK蛋白存在相互作用。4.抑制ERK通路可以降低BCRP、MRP1的功能和表达水平,但不影响NCL的表达。因此我们推测,NCL参与耐药的机制可能有以下两点:（1）通过ERK通路调控Bcl-2、c-Myc和BCRP、LRP、MRP1表达;（2）与BCRP、MRP1结合增加其功能。