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病毒感染宿主的最终结果决定于病毒与宿主之间的复杂的相互作用。一方面,宿主可以通过免疫系统的作用来抑制病毒的侵染和复制。先天性免疫系统(Innate Immunity System)是宿主抵抗病毒侵染的第一道防线,而Ⅰ型干扰素(TypeⅠ IFNs)是先天性免疫反应(Innate Immune Response)中最关键的一类分子。先天性免疫反应的核心步骤包括:(a)宿主细胞通过病毒侵染早期过程中所激活的先天性免疫信号通路,主要是NF-κB、AP-1和IRF这三类转录因子的激活诱导大量Ⅰ型干扰素的表达和分泌。(b)Ⅰ型干扰素又通过作用于细胞表面的相应受体激活几百种下游ISG(interferon-stimulated gene)分子的表达,从而使得宿主细胞进入抗病毒状态。然而,迄今为止大部分ISG分子的功能和相关分子机制依然还不是很清楚。另一方面,大部分病毒可以通过抵御或干扰宿主免疫系统的攻击来有利于自身的感染和复制。A型流感病毒(Influenza Avirus,IAV)是一类与人类有着密切关系的RNA病毒,NS1蛋白(IAV-NS1)是其一个非常重要的致病因子。IAV-NS1能够通过拮抗干扰素(IFN)的抗病毒活力和干扰细胞内的多个生理过程来帮助病毒获得更强的增殖活力和毒性,然而对于它在病毒侵染过程中是否受到宿主的调节以及相关的分子机制却少有研究。本论文的主要工作集中在研究病毒侵染宿主所激活的先天性免疫反应过程中IAV-NS1受到的调节,发现了ISG分子Herc5能够通过催化IAV-NS1的ISG15修饰来发挥其抑制IAV的抗病毒功能。此外,本文还阐述了UXT蛋白作为一个重要的NF-κB转录协同因子的发现和相关研究。
第一部分工作中,我们通过GST-pulldown加上银染和质谱的方法鉴定出ISG分子Herc5是一个新的IAV-NS1的结合蛋白。在IAV侵染宿主细胞的过程中,Herc5能够催化ISG15修饰IAV-NS1蛋白,并通过该修饰下调IAV-NS1的功能。在细胞中减少Herc5或ISG15的表达会削弱由IFN-β诱导的针对IAV的抗病毒活力,而在细胞中过表达Herc5介导的ISG15修饰系统则可以增强由IFN-β诱导的针对IAV的抗病毒活力。通过比较我们发现来自H5N1亚型禽流感病毒的IAV-NS1被ISG15修饰后所产生的修饰条带要少于来自H1N1亚型人流感病毒株IAV-PR8/34的IAV-NS1,这与对应IAV感染小鼠或人所表现出的毒性是相符的。最后,通过病毒感染细胞和小鼠的实验我们证实,IAV-NS1上ISG15修饰位点发生点突变的IAV-PR8/34病毒具有更强的增殖活力和毒性。综上所述,我们的研究发现IAV-NS1是第一个能被ISG15修饰的病毒蛋白,并且表明Herc5能够通过催化IAV-NS1的ISG15修饰来发挥抑制IAV的抗病毒功能。这些研究结果有助于更好的了解A型流感病毒与宿主先天性免疫系统之间的相互作用,为进一步解析高致病性A型流感病毒的致病分子机理提供了新的线索,也为研究ISG15修饰的抗病毒功能找到了新的思路。
第二部分工作中我们通过酵母双杂交的方法筛选并鉴定出UXT是一个新的p65的结合蛋白。UXT主要分布在核内,在TNFα刺激下能够与入核的p65发生相互作用,参与形成NF-κB转录增强子复合物。通过RNAi减少细胞内的UXT表达会导致TNFα刺激后核内NF-κB的含量和活性的下调,以及NF-κB调控基因表达的显著降低。减少细胞内的UXT表达还会导致细胞对TNF-α引起的细胞凋亡更敏感。此外,我们还发现在人的前列腺肿瘤细胞系中,UXT的表达水平与组成型NF-κB活力有一定的相关性。减少细胞内的UXT表达会导致前列腺肿瘤细胞中组成型NF-κB活性的下降。因此,我们的研究发现并证明了UXT是NF-κB转录起始复合物中一个新的重要的转录协同因子。我们希望这部分研究结果有助于加深全面了解核内NF-κB精密转录调控以及为进一步研究UXT的生理功能提供线索。