胶质瘤是较为常见的原发性脑肿瘤,约占40%,5年生存率约为20-30%。其中,胶质母细胞瘤恶性程度最高,约占胶质瘤的50%,年发生率为3/100,000-4/100,000人口。胶质母细胞瘤侵袭性强,复发率高,预后差,中位生存时间约14.6个月,3年生存率约为16%,5年生存率不到2%。近年来,虽然治疗策略和技术获得了不断的进步,但是此类患者的生存期和生存率并没有明显的提高。深入研究胶质瘤发生与发展的分子机制、并探索关键的分子靶点,将有助于突破胶质瘤治疗的瓶颈,进一步改善患者的预后。肿瘤细胞具有持续的生长增殖信号、对抗生长信号的不敏感性、抵抗细胞死亡、无限的复制能力、持续的血管生成、组织浸润和转移、避免免疫摧毁、促肿瘤的炎症反应、以及基因组不稳定等显著性特征。肿瘤能量代谢的重组在过去十年受到广泛的重视和深入的研究,并且被认为是肿瘤之十大显著性特征之一。能量作为维持细胞生长最重要的因素,对于肿瘤细胞旺盛的生长需求尤为重要。所以能量代谢也被认为是肿瘤细胞最为薄弱的环节,以能量代谢作为突破口,可能是攻克肿瘤最为有效的治疗策略。作为能量代谢中最为重要的糖代谢,无疑在肿瘤研究中受到了高度的重视,而与糖代谢相关的酶则成为研究的热点。糖原分支酶(glucogen branching enzyme 1,GBE1)蛋白分子属α-淀粉酶家族成员,在人类细胞中主要参与糖原分支的形成,是糖原形成过程中的主要酶之一。通常认为,糖原分支的形成,一方面增加了糖原水溶性,有利于其贮存;另则可以为糖原结合蛋白提供对接位点,包括糖原代谢相关酶类和调节蛋白等。糖原是细胞主要的能量储存物质,在结肠癌、胃癌、甲状腺癌和胶质瘤等多种肿瘤中,糖原的水平均显著升高。肿瘤细胞在应对营养和氧气匮乏时,糖原能够快速地代谢,以提供能量支持,维持细胞的成活与生存。另外,糖原代谢对于蛋白翻译后的修饰、生物合成以及抗氧化保护等,均具有重要作用。抑制肿瘤细胞糖原代谢能够遏制磷酸戊糖途径、核酸和脂质的合成,以及增加活性氧簇的水平,从而引起细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡等。所以,我们设想,能否通过抑制GBE1来抑制糖原代谢?从而阻断胶质瘤细胞的生长。本课题系统地阐述了GBE1在人脑胶质瘤中的表达及意义,通过下调GBE1的表达研究其对胶质瘤细胞生物学行为的影响,并初步探讨了相关的分子机制。1.GBE1蛋白在人脑胶质瘤中的表达及意义作者采用组织免疫化学染色、Western blotting和PCR技术,对118例人脑胶质瘤组织和10例非肿瘤人脑组织的GBE1蛋白表达水平和m RNA水平进行了分析,首次证实了GBE1在胶质瘤中存在过表达的状况。随后,比较分析了GBE1在各病理类型和级别的表达情况。研究发现,GBE1在正常人脑组织中的表达水平低,而在胶质瘤组织中的表达水平明显增高,并且在细胞核和细胞浆中均有表达。根据WHO分级和病理分型统计结果显示,除外WHOⅠ级和毛细胞型星形细胞瘤外,其余各级别和各病理类型胶质瘤中GBE1均存在过表达现象,并且其表达水平的高低与肿瘤恶性程度相关。本实验对纳入的118例胶质瘤患者进行了随访和临床相关资料的收集,并结合GBE1的IRS评分,分析了其与患者生存期及临床资料的关系。Mann-Whitney秩和检验结果显示,GBE1的IRS与患者的性别、年龄和肿瘤的大小之间无明显相关性。Kaplan-Meier生存曲线结果表明,GBE1蛋白表达较高和较低的两组胶质瘤患者,中位生存期分别为约14和33个月。Log-rank检验提示,GBE1表达较高的胶质瘤患者生存期更短(p<0.05)。患者生存时间多因素Cox回归分析结果显示,胶质瘤的病理级别和GBE1的IRS水平是判断患者预后的独立因素(p<0.05)。另外,作者利用TCGA和GEO数据库中胶质母细胞瘤基因表达谱数据和相关临床资料对GBE1的m RNA表达水平和预后的影响进行了分析。相对于正常脑组织,GBE1在胶质母细胞瘤中存在过表达状况。Kaplan-Meier结果证明,胶质母细胞瘤患者中GBE1基因表达水平较高组与表达水平较低组之间的总体生存率具有明显的差异,GBE1-m RN A表达水平较高的患者,其生存期更短(p<0.05)。有关胶质母细胞瘤患者生存期的Cox比例风险模型多因素分析结果提示,MGMT启动子甲基化水平、GBE1-m RN A表达水平和年龄,是影响胶质母细胞瘤患者生存率的独立预后因素。所以,检测GBE1的表达水平,并结合MGMT启动子甲基化水平、病理级别和年龄因素等进行综合考虑分析,对于判断胶质瘤患者的预后具有一定的意义。2.抑制GBE1的表达对人脑胶质瘤细胞生物学行为的影响本部分实验以人脑胶质瘤U251细胞为研究对象,通过RNAi技术下调U251细胞中GBE1的表达水平之后,观察细胞在生长与增殖、凋亡和迁移侵袭能力等方面的影响。MTT法检测结果显示,下调GBE1基因的表达水平能够明显地抑制U251细胞的活力(p<0.05)。采用平板克隆形成实验进行观察,当下调GBE1的表达时,能够明显地抑制U251的体外增殖能力(p<0.05)。细胞分裂周期检测结果亦表明,下调GBE1的表达能够引起U251细胞S期阻滞(p<0.05),明显地抑制了细胞分裂周期的进展。从流式细胞凋亡检测结果分析,下调GBE1基因的表达能够显著地诱导U251细胞调亡的发生(p<0.05)。另外,从单层细胞划痕实验和Transwell侵袭实验观察到,下调GBE1基因的表达能够明显地抑制U251细胞的体外迁移和侵袭能力(p<0.05)。综合上述实验结果,作者认为GBE1在胶质瘤发生与发展过程之中发挥了一定的促进作用,以GBE1基因为靶点,下调其在胶质瘤细胞中的表达水平,可在一定程度上达到抑制肿瘤增殖和侵袭的效果。3.初步探讨GBE1对胶质瘤细胞凋亡和侵袭相关分子的影响及其潜在的调控机制作者通过Western blotting方法,检测了胶质瘤U251细胞经GBE1-RNAi后细胞凋亡和侵袭相关标志分子的表达变化。GBE1干涉组细胞中凋亡相关分子Bax和活化的caspase3表达量有显著升高(p<0.05),而Bcl-2的表达则明显下降(p<0.05);细胞侵袭相关分子MT1-MMP表达量明显下降(p<0.05),但MMP-2的表达量未见有统计学意义的改变(p>0.05)。根据TCGA中的胶质母细胞瘤基因表达数据进行相关性分析显示,Wnt信号通路关键的调控分子β-catenin、细胞周期相关分子c-MYC、侵袭相关分子MT1-MMP、低氧诱导因子HIF-1、血管内皮生长因子VEGF、以及糖原合成酶GYS与GBE1之间均存在明显的表达相关性(p<0.05)。Western blotting和细胞免疫化学检测的结果呈现,下调GBE1在U251细胞中的表达能够引起β-catenin的蛋白表达水平下降,同时抑制了β-catenin的核转移水平。因而推测,β-catenin转录水平的降低是GBE1-RNAi引起胶质瘤U251细胞生物学行为改变的机制之一。最后,通过Western blotting和PCR技术方法检测了低氧对胶质瘤细胞GBE1表达水平的影响。结果发现,在低氧环境下,GBE1的m RNA和蛋白表达水平在U251、U87和SHG44细胞中均有显著性增高(p<0.05)。综合上述实验结果,作者认为,GBE1在人脑胶质瘤的发生与发展过程中起到了重要的促进作用。GBE1不但对判断胶质瘤患者的预后具有一定的意义,同时它可能成为一个潜在的基因治疗靶点,这为胶质瘤患者的个体化治疗提供了一种新的选择。