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研究目的胃食管反流病(Gastroesophageal reflux disease,GERD)发病机制复杂,多种因素参与GERD的发生和发展,普遍认为GERD的发生主要是由反流物对食管的化学性损伤、局部免疫炎症反应和食管内脏高敏感等因素所致。大量研究证实GERD患者,尤其是NERD患者,食管对酸和机械性刺激的敏感性升高,提示食管内脏高敏感对GERD症状的产生和持续具有重要作用。酸敏感离子通道(acid-sensing ion channel,ASICs)是一种配体门控阳离子通道,当细胞外pH下降和质子浓度增加时被激活,产生内向Na~+电流,参与化学和机械信号的传导。大量研究证实,ASICs与伤害性感受的产生和中枢致敏有关,参与疼痛的调节和产生。蛋白激酶C结合蛋白1(protein interacting with C-kinase1,PICK1)是一种高度保守的外周膜蛋白,是唯一含有PDZ(PSD-95/Dlg/ZO-1)结构域和BAR(Bin-Amphiphysin-Rvs)结构域的蛋白质。其功能多样,可以与多种蛋白质结合,在蛋白质转运和突触传递中具有重要作用。研究发现PICK1通过PDZ结构域与ASIC1结合,调节ASIC1的表达和功能。GERD内脏高敏感机制至今未明,ASIC1、PICK1是否参与GERD的发生和发展尚无明确报道。本研究意在明确GERD食管内脏高敏感与躯体感觉的关系,ASIC1和PICK1是否参与食管酸敏感性的调节。研究方法对雄性SD大鼠分别采用不同材料和直径的幽门限制术(A组:将特制18Fr Nelaton导管环套于幽门;B组:丝线结扎控制幽门直径为4.17mm;C组:丝线结扎控制幽门直径为3.42mm;D组:丝线结扎控制幽门直径为2.98mm)结合胃底结扎术的方法建立GERD大鼠模型,S组为假手术组。术后观察各组大鼠体重变化;取贲门5mm以上食管行食管大体观察和苏木素伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色病理分析;对不同幽门直径的幽门限制术后大鼠的生存率及成模率进行评估。雄性SD大鼠随机分为两组,对GERD组大鼠行幽门限制术结合胃底结扎术,控制幽门直径为3.42mm,Sham组为假手术组,分别于术前1天,术后第3、7、11、15天检测两组大鼠机械缩足反射阈值(mechanical paw withdraw threshold,MWT)和热缩足反射潜伏期(thermal paw withdraw latency,TWL);用Di I示踪法定位食管特异性背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元,术后第15天进行全细胞膜片钳检测;用Western Blot、RT-PCR的方法检测术后第15天两组大鼠食管黏膜及T3~T5 DRG中ASIC1、PICK1蛋白表达和mRNA含量。用SPSS18.0软件分析数据,计量资料用均数±标准差(χ±S)表示,生存率和成模率用百分率表示。对数据进行正态性和方差齐性检验,符合正态分布且方差齐时,两组比较用独立样本t检验,多组比较用单因素方差分析;不符合正态分布的资料根据需要使用秩和检验或Fisher确切概率法;用Chi-square的统计学方法对各组大鼠术后生存率和成模率进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.不同直径幽门限制术建立GERD大鼠动物模型的比较术后S组大鼠毛发光泽,活动敏捷。其余各组大鼠被毛粗糙、灰暗,反应迟钝,行动迟缓,饮水量、食量下降。术后15天S组和B组大鼠体重增加,两组大鼠体重无显著性差异(296.00±19.408g vs 278.50±19.156g,P=0.077),术后15天A、C、D组大鼠体重下降(168.75±13.823g,177.50±15.501g,152.00±5.701g),A、C、D组与Sham组相比,差异均有统计学意义(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。S组生存率100%,A、B、C、D组生存率分别为40%、85%、60%、25%。5组生存率不全相等,差异有统计学意义(P<0.001));其中S组与B组生存率无显著性差异(P=0.231);S组生存率与A、C、D组相比,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05,P<0.05);A组生存率与B组相比,差异有统计学意义(P<0.05);B组生存率与D组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。术后第15天取大鼠食管所见:S组食管黏膜光滑、完整,其余各组食管有不同程度黏膜糜烂、坏死、出血、溃疡或瘢痕等。15天后食管HE病理示:S组食管上皮角质层完整,上皮层薄。其余各组食管基底细胞增生,乳头延长,超过上皮的2/3以上,溃疡形成,黏膜下层炎症细胞浸润等。A、B、C、D组成模率分别为100%、41.18%、91.67%、100%。A组与B组相比,成模率差异有统计学意义(P<0.05),A组与C组相比,C组与D组相比,成模率无显著性差异(P=1.00)。B组与C组成模率差异有统计学意义(P<0.05)。2.GERD大鼠MWT下降,TWL无明显改变,DRG神经元敏感性升高造模前1天GERD组与Sham组大鼠MWT无显著性差异(49.14±15.44g vs54.63±8.80g,P=0.511);造模后第3天两组MWT明显下降,两组之间无显著性差异(9.64±6.19g vs 6.33±4.42g,P=0.307);造模后第7、11、15天GERD组大鼠与Sham组相比缩足反射阈值明显下降(7.98±5.66g vs 24.28±17.02g,P<0.05;12.08±13.78g vs36.12±16.60g,P<0.01;16.16±17.71g vs 39.40±14.97g,P<0.05)。造模前1天及造模后第3、7、11、15天,两组大鼠TWL无显著性差异(18.34±1.14s vs 18.31±0.86s,P=0.948;9.10±0.91s vs 8.43±0.80s,P=0.139;9.95±1.51s vs 9.06±1.35s,P=0.232;13.26±1.61s vs 11.70±1.84s,P=0.092;13.48±1.63s vs 12.70±1.46s,P=0.335)。膜片钳结果显示GERD组大鼠食管DRG神经元静息膜电位较Sham组去极化显著(-45.27±0.56mV vs-51.91±0.34mV,P<0.001);GERD组大鼠DRG神经元阈电流较S组明显降低(25.91±5.98pA vs 83.64±3.88pA,P<0.001);2倍、3倍阈电流刺激下GERD组、Sham组大鼠DRG神经元动作电位发放频率明显增加(6.27±0.76 vs3.36±0.41,P<0.001)、(10.91±0.77 vs 5.64±0.49,P<0.001)。3.ASIC1在GERD组大鼠食管黏膜中表达下调,PICK1在GERD组大鼠食管黏膜中表达上调Western Blot结果显示GERD组大鼠食管黏膜ASIC1蛋白表达下降(1.1594±0.4678 vs 0.7190±0.2284,P<0.05);GERD组与Sham组大鼠DRG中ASIC1蛋白表达无显著性差异(1.4948±0.2657 vs 1.5180±0.6213,P=0.925)。与Sham组相比,GERD组大鼠食管黏膜PICK1蛋白表达上调(0.5109±0.2484 vs 0.9141±o.3924,P<0.05)。GERD组与Sham组大鼠DRG中PICK1蛋白表达无显著性差异(0.4963±0.4560 vs 0.3183±0.2476,P=0.375)。RT-PCR结果显示GERD组大鼠食管黏膜ASIC1 mRNA表达下降,差异有统计学意义(1.0207±0.2126 vs 0.6559±0.1193,P<0.01);GERD组与Sham组大鼠DRG中ASIC1 mRNA含量呈下降趋势,差异无统计学意义(0.9204±0.2190 vs1.1055±0.2811,P=0.232)。与Sham组相比,GERD组大鼠食管黏膜PICK1 mRNA表达上调,差异有统计学意义(1.3428±0.1621 vs 1.0111±0.1626,P<0.01),GERD组与Sham组DRG中PICK1 mRNA含量无显著性差异(1.0295±0.2249 vs1.0176±0.1978,P=0.924)。结论1.控制幽门直径为3.42mm的幽门限制术结合胃底结扎术是建立GERD组大鼠模型的可靠方法;2.GERD组大鼠食管特异性DRG神经元兴奋性增高,痛觉行为学显示GERD组大鼠机械痛觉敏感性升高,提示内脏高敏感影响躯体感觉的形成;3.ASIC1在GERD组大鼠食管黏膜表达下降,PICK1在GERD组大鼠食管黏膜表达升高,提示ASIC1、PICK1参与GERD食管内脏高敏感的形成。