[研究背景]再生障碍性贫血(再障,aplastic anemia,AA)是一种由多种病因引起的获得性骨髓衰竭综合征,临床表现为不同程度的全血细胞减少所致的贫血、出血和感染,尤其是重型再障,起病较急,进展迅速,重度贫血、脏器出血以及严重感染发生率高,严重威胁患者的生命安全,是难治性血液系统疾病之一。再障发病呈世界性分布,国内发病率远高于西方国家,并以中青年居多。再障发病机制复杂,呈明显异质性和重叠性,主要概括为"种子""土壤"和"虫子"三个方面:"种子"造血干细胞缺陷,包括造血干细胞量的减少和质的缺陷;作为"土壤"的造血微环境异常,包括骨髓基质细胞和造血生长因子的异常;而"虫子"则代表紊乱的免疫功能,异常活化的T细胞及其分泌的细胞因子使造血干细胞凋亡增多;此外某些遗传因素也被认为与再障的发病有关。近年来,随着免疫学以及细胞遗传学等技术的发展,再障的发病机制的研究获得长足进步,目前普遍认为获得性再障是一种T细胞异常活化导致的自身免疫性疾病,免疫攻击的靶细胞主要是骨髓中的造血十/祖细胞。除此以外,许多潜在的自身抗原能够诱导异常的免疫反应进而攻击造血干/祖细胞,其相应的自身抗体已被大量检测到,提示B细胞介导的体液免疫在再障发病中也起到一定作用。MicroRNA(miRNA)是一类序列高度保守的,长度约为19～25个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA,通过和靶基因信使RNA(mRNA)碱基配对引导沉默复合体降解mRNA或阻遏其翻译,从而对基因进行转录后表达的调控,参与生命过程中的许多重要进程,包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化以及脂肪代谢等。随着生物信息学的发展,越来越多的miRNA分子及其作用被发现,其中miR 146a和miR 182分别在固有免疫和适应性免疫方面发挥着重要的调节作用。既往研究表明在一些自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等,许多异常表达的miRNA通过作用于其靶基因参与疾病的发生发展,而miRNA与再障的相关性研究少有报道。本课题中我们首先收取3个重型再障患者和3个健康对照的骨髓T细胞,应用miRNA芯片技术筛选出两组中差异表达的miRNA,经扩大样本量验证后得出miR34a表达量在再障骨髓T细胞中明显升高,进而进行功能实验并建立再障的动物模型,探讨miR34a及其靶基因在再障发病机制中的作用,明确miR34a介导T细胞活化的分子机制,为近一步阐明再障的免疫发病机制以及再障的靶向治疗提供了理论依据。人白细胞抗原(human leukocyte antigen.HLA)-G是一种非经典的HLA I类基因,不同于经典的HLAI类基因,HLA-G表现为低度多态性,其编码蛋白主要存在于母胎界面的滋养层细胞、胸腺、角膜、胰腺以及红系祖细胞和内皮前体细胞。HLA-G分子有七种异构体,包括4种膜表面蛋白和3种可溶性蛋白,通过直接作用于表达其抑制性受体免疫球蛋白样转录子(immunoglobulin-like transcripts,ILTs)的细胞发挥免疫抑制效应,诱导免疫耐受。ILTs主要包括三种:ILT2(LILRB1/CD85j),ILT-4(LILRB2/CD85d)和 KIR2DL4(CD158d),其中ILT2主要见于NK细胞、淋巴细胞和树突状细胞,ILT4主要见于单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞。近年来随着研究深入,HLA-G/ILTs的免疫抑制作用受到越来越多的关注,现已发现在器官移植、肿瘤、病毒和细菌感染以及自身免疫性疾病等病理情况下HLA-G蛋白表达异常,影响T、B、NK等免疫细胞的正常作用,从而诱导免疫耐受和肿瘤的免疫逃逸等。再障是一种免疫紊乱导致的造血衰竭综合征,目前尚无文献报道HLA-G是否参与再障发生发展,本课题通过检测再障患者骨髓和外周血细胞中HLA-G及其受体的表达情况,初步探讨HLA-G/ILTs在再障免疫紊乱中发挥的作用,有可能为再障的免疫机制研究开辟新的领域。第一部分:AA中miR34a/DGK ζ增强骨髓T细胞活化的作用及机制研究研究目的:通过miRNA芯片技术筛选出AA骨髓T细胞中异常表达的miRNA分子,扩大样本量验证该miRNA分子的表达量,分析其与临床特征的关系,通过临床标本检测以及建立再生障碍性贫血的动物模型,明确该miRNA分子在AA骨髓T细胞活化中的作用,近一步确定该miRNA的靶基因并探讨其参与T细胞活化的分子机制,从而为AA的免疫机制研究提供新的思路。研究方法:1.标本采集:收集49例AA患者和28例健康对照的骨髓标本,其中49例AA患者中包括33位重型再障患者和16位非重型再障患者。2.筛选miRNA分子:取3例重型再障患者和3例健康对照的骨髓单个核细胞,经免疫磁珠分选出CD3+T细胞,应用miRNA芯片技术筛选两组骨髓CD3+T细胞中差异表达的miRNA分子。3.验证芯片结果:实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测骨髓单个核细胞中miR34a的表达情况,并分析miR34a与再障患者临床特征的相关性。4.确定miR34a在骨髓naive T细胞的表达情况:免疫磁珠分选8例重型再障患者和8例正常人naive T和non-naive T细胞,应用PCR检测naive T和non-naive T细胞在两组中的表达量,明确miR34a表达重升高并非AA骨髓T细胞活化所致的反应性升高。5.确定miR34a在AA中发挥作用的靶基因:应用PCR及免疫印迹法(western blot)检测miR34a可能的靶基因二酯酷甘油激酶(diacylglycerol kinase.DGK)ζ在骨髓单个核细胞的表达水平,并分析miR34a和DGKζ表达相关性。6.体外功能实验探究miR34a在AA骨髓T细胞活化中的作用6.1慢病毒转染AA骨髓单个核细胞:将含有miR34a抑制序列和无义序列的慢病毒转染AA骨髓单个核细胞,5天后收集细胞后在荧光显微镜下观察并用流式细胞术检测慢病毒转染效率。6.2流式细胞术检测T细胞活化:收集细胞后标记CD4和CD8以及T细胞活化的标志分子CD25和CD69,比较两组中CD4+和CD8+T细胞的活化水平。7.比较miR34a基因敲除小鼠(miR34a-/-)和正常野生小鼠(wild-type,WT)在骨髓造血系统的区别:进行外周血细胞和骨髓造血干/祖细胞计数,同时流式细胞术检测两组外周血、骨髓、脾脏、淋巴结等处的CD4+和CD8+细胞的比例。8.小鼠体外功能试验探究miR34a在T细胞活化中的作用:取miR34a-/-和WT小鼠的脾脏和淋巴结细胞于细胞培养板中,加入anti-CD3和anti-CD8 mAbs刺激T细胞活化,比较两组T细胞活化状态、增殖情况以及下游信号分子的表达水平。8.1 T细胞表面活化标志检测:应用流式细胞术检测T细胞表面CD25和CD69的表达水平。8.2 T细胞增殖检测:应用流式细胞术直接检测两组T细胞Brdu的掺入率以及CFSE标染后应用流式观察细胞分裂以明确miR34a对T细胞增殖的影响。8.3 T细胞活化信号通路中分子检测:应用western blot检测两组细胞中DGKζ的表达量以及下游信号分子ERK的磷酸化水平。9.构建再障的动物模型:将miR34a-/-和WT小鼠的淋巴结细胞经尾静脉注入经亚致死量照射的半相合受体鼠,监测小鼠血常规变化,12天后比较两组小鼠骨髓造血情况以及T细胞增殖情况。将小鼠股骨进行石蜡包埋切片后HE染色观察骨髓增生情况,应用流式细胞术检测两组小鼠骨髓中造血干/祖细胞比例和数量,同时检测两组中T细胞的比例。结果:1.芯片结果:应用芯片技术在重型再障和健康对照骨髓T细胞之间筛选出31个表达明显差异的miRNA分子,其中16个过表达而15个表达水平降低。2.验证芯片结果:RT-PCR检测miR34a表达量在AA中明显升高,且在重型再障组和非重型再障组之间差别较大。同时miR34a水平与再障患者的外周血中性粒细胞数和网织红细胞计数均成反比。但在AA组中miR34a水平在naive T细胞和non-naive T细胞之间无明显差别。3.确定靶基因:参照既往文献报道和生物信息学软件分析,选取7个基因作为候选基因,其中DGKζ mRNA水平在AA组中明显低于健康对照组且与miR34a水平成负相关,AA骨髓单个核细胞中DGKζ蛋白含量亦明显降低。同时AA组骨髓T细胞表达CD69水平明显高于对照组。4.下调再障骨髓T细胞中miR34a的表达量使T细胞活化水平降低:转入miR34a抑制序列的再障骨髓T细胞表达DGKζ明显增多,其表面CD69和CD25表达量明显降低。5.MiR34a-/-小鼠和野生型小鼠骨髓造血细胞量的比较:miR34a-/-小鼠外周血和骨髓中CD4+T细胞的比例较野生小鼠明显降低,而在外周血各系细胞数、骨髓有核细胞数、骨髓造血干/祖细胞数以及CD4+T细胞和CD8+T细胞在脾脏和淋巴结等处的比例在两组均无明显差别。6.MiR34a-/-小鼠的体外功能实验证明miR34a敲除能够显著降低小鼠T细胞的活化水平和增殖能力:小鼠淋巴结细胞在体外经anti-CD3和anti-CD8 mAbs刺激后,miR34a-/-组T细胞表面的CD69和CD25水平较野生组明显降低,Brdu掺入率亦明显减低,CFSE染色显示miR34a-/-组细胞分裂率明显低于野生组。除此以外,作为降解二脂酰甘油(diacylglycerol,DAG)的重要激酶DGKζ在T细胞活化以后明显降低,但在miR34a-/-组其降低幅度明显小于野生组,同时T细胞活化信号通路中的下游分子ERK的磷酸化水平在MiR34a-/-组明显低于对照组。7.再障动物模型中miR34a敲除使T细胞功能减弱:应用野生型和miR34a敲除的淋巴结细胞均可成功构建再障动物模型,两种淋巴细胞均可在受体鼠骨髓中攻击造血干/组细胞,但在miR34a-/-组受体鼠骨髓中造血干/组细胞比例和数量明显高于野生组,同时miR34a-/-组骨髓中CD8+T细胞比例明显低于野生组。结论:1.再障患者和健康对照的骨髓T细胞miRNA表达谱存在明显差异,提示miRNA分子可能参与AA中T细胞介导的免疫紊乱。2.逆转AA骨髓T细胞中miR34a的表达水平可以明显降低T细胞的活化水平。3.再障动物模型的建立更加证明了 miR34a基因敲除后T细胞活化增殖能力减弱。4.再障中升高的miR34a通过作用于DGKζ显著增强了 T细胞的活化水平,从而在AA的发生发展过程中发挥重要作用,有望成为AA治疗的新靶点。第二部分:AA中HLA-G/ILT2抑制骨髓B细胞生长的作用及机制研究研究目的:明确HLA-G及其受体ILT2、ILT4在AA骨髓和外周血中的表达情况,探究HLA-G/ILT2相互作用对AA骨髓中B细胞的影响以及可能的分子机制,为再障的免疫机制研究提供新的方向。研究方法:1.标本采集:收集46例再障患者和28例正常对照的外周血和骨髓,其中包括31例重型再障患者和15例非重型再障患者,分离血浆、骨髓上清和单个核细胞。2.应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测再障组和对照组骨髓上清和外周血浆中可溶性HLA-G的水平。3.应用real-time PCR检测再障组和对照组骨髓和外周血单个核细胞中HLA-G、ILT2和ILT4在转录水平的表达量。4.应用流式细胞术检测再障组和对照组骨髓和外周血单个核细胞表面HLA-G、ILT2和ILT4蛋白的表达量。5.应用流式抗体标染再障患者和健康对照骨髓中CD19+B细胞表面的sIgD和sIgM.以此将CD19+细胞分为祖/前B细胞、未成熟B细胞和成熟B细胞,同时应用流式细胞术检测ILT2在各群细胞的表达量。6.体外功能实验:从正常对照骨髓单个核细胞中应用免疫磁珠分选CD19+ B细胞,将其种于铺有OP9基质细胞的培养板中,同时加入细胞因子IL-7、SCF和Flt3-L。实验组加入重组人HLA-G蛋白或含有高浓度HLA-G的再障患者骨髓上清,通过比较各组B细胞Brdu的掺入率明确HLA-G对B细胞生长的作用。除此之外,应用anti-ILT2和anti-HLA-G中和抗体阻断HLA-G/ILT2的结合,比较阻断组和非阻断组B细胞Brdu掺入率证明HLA-G对B细胞生长的作用。研究结果:1.可溶性HLA-G在再障骨髓上清中明显高于正常对照组,但在外周血浆中两组无明显差别,同时发现在骨髓上清中可溶性HLA-G水平明显高于外周血浆,提示可溶性HLA-G在骨髓和外周血中分布不均,在此二处对免疫细胞的作用强度可能不同。2.再障组骨髓单个核细胞中ILT2mRNA的表达量明显高于对照组,外周血中无明显差别;同时外周血和骨髓中ILT4 mRNA的表达量在两组中无明显差异。3.再障组骨髓B细胞表达ILT2蛋白的比例明显高于对照组,CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD14+单核细胞表面ILT2、ILT4蛋白水平在两组无明显差异,外周血单个核细胞中亦无明显差异。4.再障骨髓B细胞各亚群比例呈现异常,成熟B细胞比例明显增高,而原/祖B细胞比例明显降低;同时各亚群表达ILT2的水平有差异,对照组成熟B细胞表达ILT2水平最高,未成熟B细胞次之,原/祖B细胞最低,而在再障组成熟B细胞表达ILT2水平与对照组无异,而原/祖B细胞和未成熟B细胞表达ILT2明显增高。5.HLA-G/ILT2相互作用抑制骨髓B细胞的生长:与空白对照相比,与重组人HLA-G蛋白或含有高浓度HLA-G的再障患者骨髓上清共孵育的骨髓B细胞Brdu掺入率明显降低,而应用anti-ILT2或anti-HLA-G抗体干扰HLA-G和ILT2结合的阻断组B细胞Brdu掺入率明显高于非阻断组。同时与富含sHLA-G的再障骨髓上清共培养的正常骨髓B细胞的Brdu掺入率较加入正常对照骨髓上清组明显下降。结论:1.具有免疫抑制作用的HLA-G及其受体ILT2在再障骨髓中异常表达,提示HLA-G/ILT2可能参与再障免疫紊乱状态的发生发展。2.体外功能实验证明可溶性HLA-G与骨髓B细胞表面ILT2结合能够抑制骨髓B细胞的生长,提不再障骨髓上清中异常升高的可溶性HLA-G作用于高表达IILT2的原/祖B细胞和未成熟B细胞从而抑制其生长,最终导致原/祖B细胞和未成熟B细胞明显减少,而成熟B细胞比例相对增高。3.抑制HLA-G和ILT2结合有助于再障骨髓B细胞数量的恢复,为再障B细胞相关免疫机制研究提供了新方向。