目的　　 近年来，我院临床感染的铜绿假单胞菌中出现一种新的耐药表型，对碳青霉烯类抗生素耐药，却对头孢他啶敏感，对头孢吡肟敏感或中介。本研究旨在探讨介导此型耐药的机制，为临床治疗、预防和感控提供理论基础。　　 方法　　 1.收集确认表型:临床分离经法国生物梅里埃Vitek2-compact全自动微生物分析仪鉴定的该型铜绿假单胞菌，用琼脂稀释法复查药物敏感性，确认为此耐药新表型。　　 2.β-内酰胺酶分析:用反复冻融方法提取细菌耐药酶，通过改良三维试验检测该型菌是否产能分解碳青霉烯类和头孢他啶、头孢吡肟等药物的β-内酰胺酶。　　 3.影响碳青霉烯类药物进入细菌的外膜蛋白通道及编码通道蛋白的基因分析:运用超声破碎法提取细菌外膜蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分析耐药株是否发生外膜蛋白的改变。在此基础上，提取细菌DNA，扩增编码外膜蛋白的oprD基因，进行测序分析，寻找引起外膜蛋白改变的基因基础。同时用实时定量RT-PCR检测oprD基因表达量是否存在变化。　　 4.可能导致碳青霉烯类药物外排的因素分析:运用实时定量RT-PCR检测编码铜绿假单胞菌外排泵系统的mexA,mexC，mexE和mexY是否存在过度表达，其调控基因是否存在改变。　　 5.体外模拟试验:用亚胺培南和美罗培南对敏感的铜绿假单胞菌进行体外诱导试验，观察是否能诱导出相同的耐药表型，并按上述研究方法检测诱导株是否存在相同的基因型变化，证实对临床分离株的研究结果。　　 结果　　 1.共收集了29株该类型的铜绿假单胞菌，最低抑菌浓度(MIC)结果为对亚胺培南和美罗培南轻度或中度耐药，对头孢他啶和头孢吡肟为敏感或者中介。　　 2.全部29株菌均不产生碳青霉烯酶，和能分解头孢他啶和头孢吡肟的β-内酰胺酶。　　 3.与铜绿假单胞菌ATCC27853和临床分离的碳青霉烯类敏感株相比，29株菌中，7株外膜蛋白整体缺失或减少，18株在Mr43000～66000之间可见Mr46000外膜蛋白明显缺失或者减少，4株外膜蛋白无明显改变。对oprD基因测序发现在外膜蛋白改变的菌株中存在多点突变、少量缺失，新碱基插入，以及提前出现终止密码子。结果导致外膜蛋白的改变和丢失。　　 4.外排系统调控基因发生点突变，导致外排系统基因的过度表达，产生过多的外排泵蛋白质。其中以mexXY-OprM和mexAB-OprM过度表达为主，其他外排系统有个别表达增加。　　 5.采用亚胺培南和美罗培南诱导后，第5天出现对2种药物的耐药，且美罗培南诱导株对2种药物敏感性降低速度明显快于亚胺培南诱导株:三维试验诱导株未检出相应的耐药酶;SDS-PAGE电泳显示Mr46000外膜蛋白有缺失或者减少;oprD外膜蛋白基因测序发现有碱基突变产生终止密码子以及新的碱基插入导致移码突变。外排基因表达显示以MexA过度表达为主，同时伴有其他外排系统的过度表达。稳定性分析发现5株诱导株的耐药表型稳定，另1株外排系统表达量呈现持续升高，导致MIC值的升高。　　 结论　　 1.不产生碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌，对碳青霉烯类药物的耐药与编码外膜蛋白OprD的基因发生碱基缺失、突变、插入相关，这些改变引起药物进入菌体的外膜蛋白通道改变使药物更不易进入，是导致此型铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因。　　 2.外排系统调控基因突变引起外排泵mexXY-OprM和mexAB-OprM的过度表达，使进入菌体药物逆浓度差被大量排出，是导致此型铜绿假单胞菌对美罗培南耐药的主要原因。　　 3.本研究用亚胺培南和美罗培南对敏感的铜绿假单胞菌进行诱导，证实了以上结论。说明处于大量碳青霉烯药物的环境压力下，铜绿假单胞菌易发生以上二类机制改变所导致的耐药。