背景急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)以肺水肿和顽固低氧血症为临床特点,死亡率高达40%。促进肺泡上皮钠通道(ENaC)介导的Na+转运能够加速肺水肿的吸收,从而改善氧合。胰岛素已被证实参与ALI时肺泡液体清除(AFC)过程,但是,其具体调控机制目前尚未完全阐明。目的通过建立脂多糖(LPS)诱导的ALI模型,观察胰岛素对ALI小鼠AFC和ENaC的作用,并探讨血清糖皮质激素诱导激酶-1(SGK1)在胰岛素信号中的作用；同时通过原代分离纯化的2型肺泡上皮(AT 2)细胞,进一步探讨胰岛素活化SGK1进而调控ENaC的信号机制,为临床上ALI/ARDS肺水肿的治疗提供理论依据。方法(1)40只小鼠随机分为4组：对照组(Control),LPS组(LPS),LPS+胰岛素组(LI)和EMD638683+LPS+胰岛素组(ELI)。ELI组小鼠连续2天以EMD638683 (20 mg/kg·d-1)灌胃,余小组以等量生理盐水灌胃。第2天灌胃后,LPS组、LI组及ELI组小鼠经气管插管向气管内注入LPS (5 mg/kg溶于50μL生理盐水),对照组小鼠注入等量生理盐水。6h后,LI组及ELI组小鼠经尾静脉注入胰岛素(0.1U/kg溶于0.2 mL 5%葡萄糖注射液),对照组与LPS组则注入等量生理盐水。胰岛素作用6h后麻醉各组小鼠,收集气管及肺组织。每组随机抽取5只,左肺行肺湿/干重比(W/D)检测,右肺行AFC检测；余5只采用HE染色及透射电镜评估肺组织病理学改变、免疫组织化学分析检测肺组织ENaC表达及分布情况、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肺组织ENaC蛋白表达水平变化。(2)原代分离纯化小鼠2型肺泡上皮(AT 2)细胞,并进行细胞爬片,分为3组：①对照组：无血清培养基培养2.5 h；②胰岛素组：无血清培养基培养30 min后加100 nM胰岛素继续培养2 h；③胰岛素+GSK650394组：含1μM GSK650394的无血清培养基培养30 min后加100 nM胰岛素继续培养2 h。细胞爬片处理后行激光共聚集扫描检测ENaC蛋白表达水平变化。(3)原代分离纯化的小鼠AT 2细胞随机分为6组：①对照组：无血清培养基；②胰岛素组：无血清培养基培养30 min后加入100 nM胰岛素；③LY294002+胰岛素组：含10μM LY294002的无血清培养基培养30min后加入胰岛素100 nM；④PP242+胰岛素组：含1μM PP242的无血清培养基培养30 min后加入胰岛素100nM；⑤雷帕霉素+胰岛素组：含0.1μM雷帕霉素的无血清培养基培养30 min后加入胰岛素100nM；⑥GSK650394+胰岛素组：含1μM GSK650394的无血清培养基培养30 min后加入胰岛素100 nM；胰岛素作用2 h后收集细胞,Western blot检测肺组织ENaC蛋白表达水平、SGK1磷酸化水平,并采用免疫共沉淀检测mTORC与SGK1的相互作用。(4)20只小鼠随机分为4组：LPS组(LPS)、LPS+胰岛素组(LI)、PP242+LPS+胰岛素组(PLI)及雷帕霉素组+LPS+胰岛素(RLI)。PLI组及RLI组小鼠经腹腔分别给予PP242 (20 mg/kg)或雷帕霉素(5 mg/kg),LPS组及LI组则给予等量DMSO; 30 min各组小鼠后行气管插管并向气管内注入LPS (5 mg/kg溶于50μL生理盐水)；6h后LI组、PLI组及RLI组小鼠经尾静脉注入胰岛素(0.1 U/kg溶于0.2 mL 5%葡萄糖注射液),LPS组小鼠则注入0.2 mL生理盐水。6h后收集气管及肺组织,检测AFC、ENaC蛋白表达水平和SGK1磷酸化水平。结果(1)与对照组相比,LPS组肺损伤评分明显增加,肺泡上皮细胞超微结构出现显著病理性改变；胰岛素能够减轻LPS诱导的肺组织损伤,并显著减轻肺水肿程度；而SGK1抑制剂能够显著抑制胰岛素促进肺水肿吸收的效应。同时,LPS组AFC明显降低,W/D显著增加,α-,β-和y-ENaC蛋白表达水平也显著降低,胰岛素显著增加AFC,降低W/D,并上调α-,β-和y-ENaC蛋白表达水平,而SGK1抑制剂显著、但并不完全地抑制了胰岛素的效应。(2)α-,β-和y-ENaC主要表达于肺泡上皮细胞胞膜上；胰岛素使α-,β-和y-ENaC表达水平较对照组显著升高；SGK1抑制剂使胰岛素上调α-,β-和y-ENaC的作用明显减弱。(3)胰岛素作用于肺泡上皮细胞后,SGK1磷酸化水平和α-,β-和y-ENaC蛋白表达水平明显上调；分别给予LY294002、PP242和SGK1抑制剂后,胰岛素诱导的SGK1磷酸化水平和α-,β-和y-ENaC蛋白表达水平显著下降,而雷帕霉素对胰岛素的效应无明显影响。免疫共沉淀提示SGK1与mTORC2组成成分Rictor、SIN1结合,而并不与mTORC1组成成分Raptor结合,并且胰岛素可使SGK1-Rictor和SGK1-SIN1结合增加。(4)在ALI小鼠,PP242显著抑制了胰岛素诱导的AFC上调、SGK1磷酸化和α-,β-和y-ENaC蛋白表达增加的作用,而雷帕霉素则无明显抑制效应。结论(1)胰岛素能够上调ALI小鼠肺组织ENaC的表达,从而加速肺泡水肿液的清除,减轻肺组织损伤。(2)胰岛素促进肺泡上皮细胞ENaC表达的作用部分是通过磷酸化SGK1来调控的。(3)mTORC2是胰岛素激活肺泡上皮细胞SGK1,从而调控ENaC信号通路中必不可少的关键信号节点。