慢性髓细胞白血病(Chronic Myeloid Leukaemia，CML)是一种起源于多能造血干细胞异常的骨髓恶性增生性疾病，具有特征性融合基因——BCR-ABL。为进一步阐明CML的发生发展机理，人们一直在尝试制备BCR-ABL融合基因转基因小鼠实验模型。理想的CML实验动物模型应能有效地模拟人类CML疾病的临床表现，为CML的研究提供理想的实验研究平台。但是目前多数BCR-ABL转基因小鼠却表现为急性淋巴细胞白血病，试验结果并不令人满意。 本实验室试图利用Tet-On诱导系统定时定量的控制BCR-ABL融合基因，在小鼠出生后诱导P210bcr-abl表达，同时利用bcr启动子特异控制Tet-On系统调控蛋白的表达，使P210bcr-abl在小鼠造血干细胞和髓系血细胞中特异表达。通过受时空控制的P210bcr-abl表达避免P210bcr-abl的胚胎毒性，制备符合人CML慢性期疾病表现的BCR-ABL转基因小鼠模型，用于CML发生、发展、转归和干预的基础和临床研究。在前期研究中，本实验室已经成功克隆了1.1 kb人bcr启动子并证实其在髓系细胞中具有相对组织特异性表达的特性，成功构建了pber-Tet-On-tTS和pTRE2-BCR-ABL-Hyg两个重组质粒。 在上述工作的基础上，我们首先将pbcr-Tet-On-tTs和pTRE2-BCR-ABL-Hyg两个重组质粒共转染人急性髓细胞白血病细胞株HL-60细胞，采用强力霉素DOX诱导bcr启动子控制的调控蛋白rtTA在髓系血细胞中特异表达，双转染阳性的HL-60细胞中P210bcr-abl的表达与DOX浓度存在量效关系。 在细胞水平验证Tet-On调控的、特异性表达BCR-ABI_，融合基因表达系统的有效性后，我们将bcr-Tet-On-tTS和TRE2-BCR-ABI，基因元件通过显微注射的方法分别或共注射到ICR×C57BL/6杂交Fl代鼠的雄原核中，试图制备Tet-On系统调控融合基因BCR-ABL表达的转基因小鼠模型。 转基因整合的鉴定是进行转基因动物制备的重要环节之一，聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)因其灵敏度高、操作简便等原因而成为转基因动物筛选的主要检测方法之一。为了提高PCR法筛选BCR-ABL融合基因转基因小鼠检测的准确性与可信度，我们从模板质量、引物、Taq酶浓度、Mg2+浓度、退火温度等方面对用于BCR-ABL融合基因转基因小鼠初筛的PCR方法进行优化，努力提高PCR反应的灵敏度与特异性。同时我们通过严格操作规范，协同紫外照射等方法来避免环境污染。 在本研究中，我们在116只受体鼠中移植了2550个原核显微注射卵，共出生小鼠212只，显微注射的成功率为60.9％，小鼠出生率为8.3％。其中TRE2-BCR-ABL和bcr-Tet-On-tTS双基因注射移卵1709个，出生小鼠37只，小鼠出生率为2.2％；TRE2-BCR-ABL单基因注射移卵281个，出生小鼠25只，小鼠出生率为8.9％；bcr-Tet-On-tTS单基因注射移卵560个，出生小鼠150只，小鼠出生率为26.8％。我们对出生的转基因小鼠采用优化后的PCR方法进行了初筛，结果筛选到三只BCR-ABL基因阳性鼠，其中一只经Southern blot实验证实，其后代共有21只鼠，均未检测到BCR-ABL基因整合的阳性鼠。目前没有筛选到转pbcr-Tet-On-tTS基因阳性的小鼠。 目前，我们正在积极地分析原因，以期能够尽快获得Tet-On系统调控融合基因BCR-ABL表达的转基因小鼠模型。