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目的：构建稳定表达GFP的整合型重组布鲁氏菌16M和M5（以下简称GFP-布鲁氏菌16M和M5）；比较GFP-布鲁氏菌16M和M5与正常布鲁氏菌16M和M5在巨噬细胞中的存活能力，证明GFP基因的转入不会影响后续实验的进行。分析GFP-布鲁氏菌16M和M5进入细胞后与宿主细胞中的溶酶体、内质网、高尔基体结合产生的荧光强度；分析GFP-布鲁氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬细胞的数量；对侵染初期与胞内溶酶体、内质网、高尔基体结合的时间测定，为布鲁氏菌在细胞内的生存繁殖及其分子机制研究提供理论参考。方法:将pMC-221-GFP载体电转化进入布鲁氏菌16M和M5感受态细胞，稳定传代后获得GFP-布鲁氏菌16M和M5。将GFP-布鲁氏菌16M和M5与正常布鲁氏菌16M和M5培养至对数期收集菌体，用麦氏比浊法至所需浓度，按照细菌和细胞比例为100：1进行侵染，利用平板计数法检测其在胞内的存活能力；激光共聚焦显微镜观察胞内GFP-布鲁氏菌与溶酶体，内质网和高尔基体之间的结合，并检测出GFP-布鲁氏菌16M和M5与溶酶体、内质网和高尔基体结合后产生的荧光强度；用流式细胞仪测定侵染初期GFP-布鲁氏菌进入细胞及与胞内溶酶体、内质网、高尔基体初次结合的时间。结果：(1)成功获得整合重组型GFP-布鲁氏菌16M和M5。（2）GFP-布鲁氏菌16M和M5与正常布鲁氏菌16M和M5比较发现在小鼠巨噬细胞中的存活能力并无差别。（2）GFP-布鲁氏菌16M与溶酶体、内质网（ER）和高尔基体结合初期产生的荧光强度与布鲁氏菌M5相比较并无明显差异。（3）GFP-布鲁氏菌16M和M5侵染初期小鼠巨噬细胞产生的GFP+巨噬细胞没有明显区别，但是后期差距逐渐明显。（4）GFP-布鲁氏菌16M和M5侵染初期10min进入巨噬细胞，1.5h布鲁氏菌到达溶酶体，2h布鲁氏菌同时到达内质网（ER）和高尔基体。结论：（1）GFP基因的整合重组并不会影响布鲁氏菌16M和M5的生物特性。（2）GFP-布鲁氏菌16M和M5在侵染初期结合宿主细胞及胞内溶酶体、内质网和高尔基体的时间相同，这可能与二者同属布鲁氏菌Ⅰ型标准菌株有关。（3）GFP-布鲁氏菌到达内质网和高尔基体的时间相同，这可能与内质网和高尔基体之间的膜转移蛋白有关。（4）虽然布鲁氏菌16M和M5在侵染初期荧光强度和GFP+巨噬细胞数量上没有显著差别，但是胞内存活实验结果却恰恰相反。由此认为布鲁氏菌16M和M5进入小鼠巨噬细胞和达到溶酶体、内质网和高尔基体的能力没有区别，两者的差别还是在于胞内的生存能力，同样认为该能力也是其致病性的关键因素。