食管鳞状细胞癌是我国食管癌患者的主要病理形态,约占食管癌患者的95%,其全球发病率和死亡率分别占恶性肿瘤的第九位和第六位。目前根治性手术切除是食管癌临床的首选治疗方案,但局部复发率高,患者预后差。淋巴结转移是食管癌局部复发率高的主要因素之一,近年利用基因测序技术对淋巴结转移相关的分子标记进行研究已成为该领域的研究热点。目前已发现的食管癌淋巴结转移分子标记多为基因表达水平异常,而与食管癌淋巴结转移相关的基因突变水平分子标记鲜见报道。目的区域淋巴结转移是食管癌术后复发的主要因素之一,手术方案中淋巴结清扫范围的确定需要综合考虑患者手术伤害和癌症复发概率。现已发现多个食管癌淋巴结转移的基因表达异常分子标记,但这些标记物尚不能充分衡量食管癌淋巴结转移的风险等级。为了探索新的或潜在的食管癌淋巴结转移分子标记,更加准确地评价食管癌淋巴结转移风险,本文以食管鳞状细胞癌患者为研究对象,以患者全外显子组体细胞突变数据和临床数据为研究基础,采用统计学和生物信息学方法对食管癌淋巴结转移基因突变水平的分子标记及其敏感度和特异性等应用参数进行研究。探索与基因突变水平分子标记相关的基因功能分布和分子机制,为食管鳞状细胞癌淋巴结转移风险预测提供技术方法和理论依据。方法将符合纳入标准的91例食管鳞状细胞癌患者按照是否发生淋巴结转移分为两组,采用单因素分析对17项指标进行组间差异分析,采用二元Logistic回归分析淋巴结转移概率与组间显著差异指标的相关性,采用ROC曲线分析法对显著相关指标的应用价值进行评估,采用约登指数法判断潜在分子标记的最佳截断值并采用灵敏度和特异性对其进行评价。按照基因功能类别和基因突变频率将全外显子组基因划分为7个不同范围,通过不同范围内潜在分子标记预测结果与全外显子组的一致性判断与该指标相关的基因集。采用KEGG信号通路分析和KOG直系同源序列富集的生物信息学分析法对潜在分子标记相关基因集在不同信号通路和功能类别的分布进行研究。结果(1)组间差异单因素分析结果显示发病年龄(t=2.087,P<0.05)和密码子第一位突变点野生型碱基GC%水平(t=2.542,P<0.05)2个指标与食管鳞状细胞癌是否发生淋巴结转移组间差异有统计学意义。(2)二元Logistic回归分析结果显示密码子第一位突变点野生型碱基GC%水平(GC%of the Wildtype base in Somatic Mutation at the First Codon Position,GWSMFCP)与食管鳞状细胞癌淋巴结转移概率呈显著负相关(P<0.05),为淋巴结转移的独立风险因子。(3)ROC曲线分析结果显示GWSMFCP指标是食管鳞状细胞癌淋巴结转移的保护因素,该指标的约登指数为0.277,敏感度和特异性分别为56.6%和71.1%。(4)在全外显子组、非驱动基因、低频突变非驱动基因3个逐渐缩小的基因范围内,GWSMFCP指标与食管鳞状细胞癌患者淋巴结转移的组间差异性、相关性和预测性能评价指标一致,表明该指标的作用机制来源于广泛分布的低频突变非驱动基因。(5)在高频突变非驱动基因、驱动基因、功能失活类驱动基因、功能异常激活类驱动基因和未分类驱动基因5个范围内,GWSMFCP指标与食管鳞状细胞癌患者淋巴结转移无组间差异性、相关性和应用价值,表明该指标的作用机制与高频突变基因无相关性。(6)KEGG信号通路分析结果显示GWSMFCP指标的分子机制可能与碳代谢中膜蛋白和三羧酸循环、胆碱代谢中胆碱磷酸化代谢过程和PI3K-Akt信号通路、多种淋巴瘤转录失调信号通路等中的基因有关联性,但是与癌症常见的p53信号通路无关联性。(7)KOG同源序列聚类分析结果表明GWSMFCP指标与蛋白质翻译后修饰与转运、分子伴侣、信号转导机制相关,但仍存在很大部分与该指标相关的功能未分类基因。结论(1)GWSMFCP指标是食管鳞状细胞癌淋巴结转移风险的潜在分子标记,具有一定的临床应用价值。(2)GWSMFCP指标与普遍存在的低频突变非驱动基因相关,这些基因的功能分类主要集中在信号转导、蛋白质转运与修饰、基因未知功能。