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第一部分 rMV-Hu191对肾母细胞瘤溶瘤作用的体外细胞实验研究研究目的观察rMV-Hul91对肾母肿瘤细胞系(G401和SK-NEP-1)与人包皮成纤维细胞系(HFF-1)体外杀伤能力,为临床晚期肾母细胞瘤治疗寻找新的治疗方法。研究方法1.应用流式细胞仪检测G401、SK-NEP-1和HFF-1细胞膜表面的CD46和Nectin-4受体的表达水平。2.以不同MOI的rMV-Hu191感染G401、SK-NEP-1和HFF-I细胞,用CCK-8试剂盒评估G401、SK-NEP-1和HFF-1感染后细胞的增殖情况。3.rMV-Hul91 以 MOI=0.1 和 MOI=1 感染六孔板内的 G401、SK-NEP-1 和 HFF-1细胞后,不同时间点收集病毒并滴定病毒滴度,评估rMV-Hu191在G401、SK-NEP-I和HFF-1细胞中病毒的增殖情况。4.以MOl=0.1和MOI=1感染铺满六孔板的G401、SK-NEP-1和HFF-1细胞,取不同时间点进行甲醛固定和龙胆紫染色,直接观察rMV-Hu191对G401、SK-NHP-1和HFF-1细胞的细胞毒性作用。研究结果1.G401、SK-NEP-1和HFF-1细胞均高表达CD46受体,低表达Nectin-4受体。2.rMV-Hu191能够有效的对肾母细胞瘤细胞系G401和SK-NEP-1造成杀伤,且MOI越大杀伤能力越强。相同感染复数的rMV-Hu191对HFF-1的细胞的杀伤能力弱于肿瘤细胞。3.rMV-Hu191能有效的在G401、SK-NEP-1细胞进行自我复制,相同感染复数的rMV-Hu191在HFF-1细胞中的复制能力弱于肾母细胞瘤细胞系。第二部分rMV-Hu191杀伤肾母细胞瘤的机制研究研究目的利用表达绿色荧光蛋白(EGFP)的重组麻疹病毒(rMV-Hu191-H-EGFP)从细胞水平、蛋白水平研究麻疹病毒杀伤肾母细胞瘤的机制,为临床抗肿瘤治疗寻找更多思路。研究方法1.rMV-Hu191-H-EGFP、rMV-Hu191-P-EGFP 和 rMV-Hu191-N-EGFP 感染 Vero 细胞,观察重组麻疹病毒是否能正常表达绿色荧光蛋白。2.rMV-Hu 191-H-EGFP、rMV-Hu 191-P-EGFP 和 rMV-Hu 191-N-EGFP 和 rMV-Hu 191以M0I=0.1感染黑板96孔板中Vero细胞,测量不同时间点荧光强度的差异。3.rMV-Hu191-H-EGFP、rMV-Hu191-P-EGFP、rMV-Hu191-N-EGFP 和 rMV-Hu191感染Vero细胞,甲醛固定、龙胆紫染色后比较3种带EGFP的rMV-Hu191与rMV-Hu191杀伤能力的差异。4.rMV-Hu191-H-EGFP感染G401、SK-NEP-1细胞,收集细胞提取DNA,凝胶电泳观察是否出现与凋亡关的DNA Ladder;收取不同时间点的蛋白进行蛋白电泳实验,了解与凋亡相关的蛋白的变化。6.以 rMV-Hu191-H-EGFP 感染 G401、SK-NEP-1 细胞,加入凋亡抑制剂 Z-VAD,观察病毒合胞体破裂时间的变化情况及凋亡相关蛋白的变化情况。7.用 rMV-Hu191-H-EGFP 感染 G401、SK-NEP-1 细胞,利用 ATP 和 HMGB1的试剂检测盒检测是否有与免疫性死亡相关的ATP和HMGB1的释放。研究结果:1.rMV-Hu191-H-EGFP、rMV-Hu191-P-EGFP、rMV-Hu191-N-EGFP 都能正常表达EGFP蛋白,并且均能看到麻疹感染细胞所形成的合胞体。2.rMV-Hu191-H-EGFP、rMV-Hu191-P-EGFP、rMV-Hu191-N-EGFP 和 rMV-Hu191荧光强度差异很大,rMV-Hu191不表达荧光蛋白,rMV-Hu191-H-EGFP荧光强度弱于 rMV-Hu191-P-EGFP 和 rMV-Hu191-N-EGFP。3.rMV-Hu191-H-EGFP的杀伤能力与rMV-Hu191的最为相近,rMV-Hu 191-N-EGFP的杀伤能力最弱。4.rMV-Hu191-H-EGFP感染G401和SK-NEP-1后,DNA琼脂糖凝胶电泳实验可以观察到DNA Ladder形成。蛋白电泳结果显示与凋亡相关的蛋白被激活,说明rMV-Hu191-H-EGFP可以诱导肾母肿瘤细胞的凋亡。5.凋亡抑制剂可以延长rM V-Hu191-H-EGFP感染G401和SK-NEP-1形成的合胞体膜破裂的时间。7.rMV-Hu191-H-EGFP感染G401和SK-NEP-1细胞后上清中ATP和HMGB1都增加,提示rMV-Hu191-H-EGFP可以诱导细胞的免疫性死亡。第三部分rMV-Hu191-H-EGFP对肾母细胞瘤体内溶瘤作用及机制研究研究目的在裸鼠的肿瘤模型上进一步验证rMV-Hu191-H-EGFP对肾母细胞瘤的溶瘤效果,为rMV-Hu191-H-EGFP能进入肾母肿瘤的临床研究提供更多的证据。研究方法1.应用BALB/c小鼠建立肿瘤模型,成瘤后瘤内注射rMV-Hu191-H-EGFP和Opti-MEM,观察肿瘤生长受抑制抑制情况。2.取新鲜肿瘤组织进行冰冻切片观察rMV-Hu 191-EGFP是否能够顺利感染肿瘤组织。3.将肿瘤组织的蛋白进行蛋白电泳,观察病毒感染肿瘤的情况、观察与凋亡相关的蛋白变化情况。4.取肿瘤组织进行TUNEL实验、HE染色。研究结果1.重组麻疹病毒能够有效的感染体内的肾母细胞瘤肿瘤组织。2.注射Opti-MEM组的肿瘤不断增长,注射溶瘤病毒(rMV-Hu191-H-EGFP)后肾母肿瘤生长明显受到抑制。3.与对照组相比,实验组凋亡相关的凋亡小体及凋亡相关的蛋白(Casepase3和casepase7)被激活。