论文部分内容阅读
牙周疾病治疗的最终目标是使得已经发生破坏的牙周支持组织实现再生和修复。牙周膜是牙周支持组织的组成部分之一,而牙周膜细胞(periodontal ligament cell,PDLC)是牙周膜的主要组成细胞,是一个由多种细胞组成的异质性细胞群,主要包括:成骨细胞、破骨细胞、成纤维细胞以及未分化的间充质细胞。牙周膜细胞具有增殖及多向分化的潜能,其自我更新能力在牙周组织再生过生中发挥着重要的作用。血小板浓缩制品可由自身全血制备而来,是自体源性生长因子的主要来源之一,在临床治疗和实验研究中被广泛应用,其中富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)和浓缩生长因子(concentrate growth factors,CGF)较为常见。PRP和CGF作为自体血小板的浓缩制品,富含多种生长因子,可促进创伤愈合过程中细胞的聚集、增殖和分化,促进细胞外基质的生物合成,调控着创伤愈合的过程。目前,PRP的实验研究较多、临床应用时间较长,而对CGF的实验研究和临床应用相对较少。因此,本文旨在研究PRP、CGF对hPDLCs增殖、成骨分化的影响。第一部分全血、PRP、CGF中生长因子的对比研究目的对比研究全血、PRP和CGF中生长因子转化生长因子β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)和血小板源性生长因子(PDGF)的水平。方法选取8名健康年轻志愿者,每人抽取肘静脉全血25 mL,实验分为3组:(1)全血组(5mL全血,加入EDTA抗凝剂);(2)PRP组(10mL全血,加入EDTA抗凝剂);(3)CGF组(10 mL全血,未加抗凝剂)。对3个组分别进行血小板计数,ELISA检测其中生长因子TGF-β1、VEGF和PDGF的水平。结果1.与全血相比,PRP中血小板数量达到全血的6倍以上;CGF血小板计数结果显示无法检测出。2.与全血相比,PRP中生长因子TGF-β1、VEGF和PDGF的水平明显升高(P<0.05);而与全血相比,CGF中生长因子TGF-β1和PDGF的水平稍增高,VEGF浓度水平下降,但不具有统计学差异。结论PRP、CGF中生长因子TGF-β1和PDGF水平均增高,PRP中VEGF水平增高,而CGF中VEGF水平下降;PRP中生长因子水平增高明显(P<0.05),CGF中生长因子水平增高不具有统计学差异。第二部分人牙周膜细胞(hPDLCs)的体外分离培养及其增殖、多向分化潜能的研究目的掌握人牙周膜细胞的体外分离培养方法,研究其增殖、多向分化的潜能。方法1.收集健康第三磨牙(无龋坏、牙周炎及根尖周炎),采用酶消化结合组织块法进行人牙周膜细胞的分离培养,选取第2代细胞通过免疫组化行角蛋白、波形丝蛋白染色,鉴定人牙周膜细胞来源。2.选取人牙周膜细胞第4-6代进行后续的实验,以1 ×10~5/mL和0.8 ×10~5/mL的密度接种于培养皿,MTT法、CCK-8法研究人牙周膜细胞的增殖能力。3.人牙周膜细胞进行矿化诱导、脂化诱导,分别进行茜素红染色和油红O染色,研究人牙周膜细胞的多向分化潜能。结果1.镜下观察见:人牙周膜细胞呈长梭形、胞体丰满、胞浆均匀,细胞呈漩涡状、栅栏状排列。2.免疫细胞化学染色显示:波形蛋白阳性,角蛋白阴性。3.MTT法、CCK-8法显示:人牙周膜细胞的生长曲线基本呈S形。4.茜素红染色、油红O染色显示:人牙周膜细胞经过诱导后,可见矿化结节和脂滴形成。结论人牙周膜细胞可通过酶消化结合组织块法进行体外的分离培养;且具有增殖和多向分化的潜能。第三部分 PRP、CGF对hPDLCs增殖、成骨分化影响的研究目的研究PRP、CGF对hPDLCs增殖、成骨分化的影响。方法选取人牙周膜细胞第4-6代用于实验。1.细胞以1 × 10~5/mL的密度接种,含有10%FBS的DMEM作为基础培养基,培养24 h,制造直径约8 mm的细胞缺失区域。实验分为3组:(1)Con组:基础培养基进行培养;(2)PRP组:以含有5%PRP的基础培养基进行培养;(3)CGF组:以含有5%CGF的基础培养基进行培养。每实验组于培养的第1、4、7、10、13 d随机选一皿进行结晶紫染色,检测PRP、CGF对人牙周膜细胞增殖的影响。2.细胞以1 × 10~5/mL的密度接种,含有10%FBS的DMEM培养基培养24 h,换为不含FBS的DMEM培养基培养24 h。实验分为3组:(1)Con组:以不含FBS的DMEM培养基培养;(2)PRP组:含有不同的浓度PRP(1%、5%、10%)的DMEM培养液进行培养;(3)CGF组:含有不同浓度CGF(1%、5%、10%)的DMEM培养液进行培养。实验分别培养人牙周膜细胞24 h、48 h和72 h,分别提取24 h、48 h、72 h的细胞总蛋白。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测与成骨相关转录因子Runx2、Osx、DIx5 和 Msx2 的表达。结果1.与Con组对比,PRP、CGF促进了人牙周膜细胞的增殖。2.不同的刺激时间,同样浓度的PRP、CGF刺激hPDLCs,WB结果显示:Runx2、Osx、DIx5随着刺激时间的增加,蛋白表达量增加,呈时间依赖性,在72 h达到最高;Msx2蛋白表达量在24h时相对最高。不同浓度的PRP、CGF分别刺激hPDLCs相同的时间,WB结果显示:在同样刺激时间下,Runx2、Osx、DIx5蛋白随着PRP、CGF刺激浓度的增加,蛋白表达量增加,在10%浓度时达到最高;Msx2蛋白随着PRP、CGF刺激浓度的增加,蛋白表达量降低。结论PRP、CGF可以促进人牙周膜细胞的增殖、成骨分化:促进转录因子Runx2、Osx、DIx5的表达,抑制转录因子Msx2的表达,具有时间和剂量依赖性。