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长久以来,以神经系统为靶点的镇痛药并不能完全有效控制疼痛尤其是神经病理性疼痛。科学家们已经证实了循环系统的免疫细胞对疼痛感觉神经起着类似于汽车调光器开关的作用。进一步研究大脑和脊髓的类免疫细胞,在分子水平上建立起“免疫—疼痛”关联性实验的基本原理,将为更彻底地治疗疼痛奠定理论基础。在连接中枢神经系统(central nervous system,CNS)和先天性免疫中TLRs (Tol1-1ike receptor,TLRs)起着关键性作用。TLR4主要表达CNS中小胶质细胞上,有研究证实神经病理性疼痛的形成过程中小胶质细胞上的TLR4是关键受体。本研究拟采用基因干扰技术,抑制大鼠脊髓TLR4基因的表达,研究TLR4信号转导通路在大鼠胫骨癌痛中的作用,为研发以TLR4信号通路为靶点镇痛新药提供理论基础。第一部分大鼠胫骨癌痛模型的建立及评估目的通过对大鼠痛行为学测试、胫骨X摄片和HE染色等方法,建立并评价大鼠胫骨癌痛模型。方法雌性S-D大鼠,体重150-180g,左侧胫骨内注射大鼠体内腹水传代Walker256乳腺癌细胞,接种肿瘤细胞后2d、4d、6d、9d、12d、14d、18d和21d观测大鼠的机械触诱发痛阈值(paw withdrawal threshold,PWT)和行走痛评分(ambulatory score),并在实验结束后取双侧胫骨,X摄片观察骨质的破坏情况;病理切片,HE染色,显微镜下观察肿瘤的生长情况。结果①大鼠种瘤6d后开始出现明显的机械痛敏和自发痛,并随着荷瘤时间的延长疼痛更加严重。②大鼠种瘤6d时X线摄片可见大鼠左侧胫骨上端骨小梁轻微缺损;12d时出现多出骨小梁缺损,骨皮质有破坏;18d时骨破坏进一步加重,胫骨上端骨皮质明显破坏,大片骨质缺损。③HE染色见种瘤后6d和12d大鼠胫骨骨小梁有不同程度的破坏;18d时可见肿瘤细胞充满骨髓腔,骨小梁广泛破坏,正常骨结构缺失,严重的肿瘤细胞穿破骨皮质,侵犯周围肌肉和软组织。结论成功建立了大鼠胫骨癌痛模型。第二部分胫骨癌痛模型大鼠脊髓TLR4及其下游细胞因子表达的变化目的观察胫骨癌痛模型大鼠脊髓TLR4及其下游细胞因子表达的变化,以及脊髓小胶质细胞的激活状况。方法正常组、假手术组以及接种肿瘤细胞后6d、12d和18d大鼠的脊髓,利用免疫组化、western-blot、real time -PCR检测TLR4表达的变化;real time-PCR检测小胶质细胞激活标志(CD11b和CD14)及细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-β)表达水平的变化。结果荷瘤后6d大鼠脊髓TLR4mRNA表达和蛋白质水平即显著上调(P<0.05),12d、18d更甚(P<0.01);荷瘤后6d大鼠脊髓CD11b、CD14mRNA表达即显著升高(P<0.01);IL-1β和TNF-αmRNA表达显著升高也在荷瘤后6d(P<0.01),而IL-6和IFN-βmRNA表达显著升高则在荷瘤后12d(P<0.01)。结论大鼠脊髓小胶质细胞在胫骨癌痛发展的早期即被激活,TLR4表达上调,其下游细胞因子表达水平均进行性升高,提示该通路可能参与了大鼠胫骨癌痛的发生和发展。第三部分SiRNA抑制大鼠小胶质细胞上TLR4的表达目的体外转录合成的small interference RNA(siRNA)转染大鼠小胶质细胞(HAPI细胞株),诱导TLR4基因表达沉默,从而筛选出有效抑制TLR4基因表达的siRNA。方法根据RNA干扰的原理及siRNA的设计原则,设计4个长度为21bp的TLR4siRNA(siRNA312、siRNA439、siRNA1495和siRNA2062),另选择相同长度的无义双链RNA作为阴性对照RNA,体外转录合成siRNA,利用LipofectamineTM2000将siRNA导入HAPI细胞中,于转染后24h提取细胞的RNA, 48h提取蛋白质, real time-PCR和western-blot检测HAPI细胞上TLR4的表达。结果2μg TLR4 siRNA可减少HAPI细胞上的TLR4mRNA分别为:83%(siRNA439)、61% (siRNA312)、55% (siRNA1495)和53% (siRNA2062)。Western-blot检测结果也显示对HAPI细胞上TLR4蛋白质表达抑制效果最好的是siRNA43(9P<0.001)。结论siRNA转染小胶质细胞可有效抑制TLR4基因的表达。siRNA439效果最好。第四部分鞘内注射TLR4siRNA可减轻大鼠胫骨癌痛目的观察不同时间点鞘内注射TLR4siRNA对大鼠胫骨癌痛的影响。方法大鼠鞘内置管。荷瘤后4d或9d时给予鞘内注射TLR4siRNA( 2μg/10μl)、阴性对照siRNA(2μg/10μl)或溶媒in vivo jetPEITM10μl,1次/d,连续3d,末次鞘内注射后24h观察大鼠PWT值和行走痛评分的变化。痛行为学测试后,取大鼠脊髓L4~6,western-blot、real time-PCR检测TLR4表达的变化;real time-PCR检测CD11b、CD14、IL-1β?IL-6?TNF-α和IFN-β表达水平的变化。结果荷瘤后4d鞘内注射TLR4siRNA可完全抑制大鼠的胫骨癌痛,荷瘤后9d鞘内注射TLR4siRNA能缓解大鼠胫骨癌痛,但不能完全阻止疼痛的发展。鞘内注射TLR4siRNA可显著降低模型大鼠脊髓的TLR4mRNA的表达和蛋白质水平,CD11b、CD14、IL-1β?IL-6、TNF-α和IFN-βmRNA表达也显著降低。结论鞘内注射TLR4siRNA可有效抑制大鼠脊髓TLR4及其下游细胞因子的表达,抑制小胶质细胞的激活,从而缓解大鼠胫骨癌痛。第五部分TLR4/NF-κB信号转导通路在大鼠胫骨癌痛中的作用目的研究鞘内注射NF-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)和TLR4siRNA对大鼠胫骨癌痛的作用。方法荷瘤后9d给予鞘内注射PDTC(20μg/10μl)或生理盐水10μl,2次/d,连续3d,末次鞘内注射后6h观察大鼠PWT值和行走痛评分的变化。痛行为学测试后,取大鼠脊髓L4~6,结合第四部分的实验标本,免疫组化、western-blot、real time-PCR检测NF-κB p65表达的变化;real time-PCR检测IL-6和TNF-α水平的变化。结果鞘内注射PDTC可缓解大鼠的机械痛敏和自发痛;且能显著降低模型大鼠脊髓NF-κB p65 mRNA的表达和蛋白质水平(P<0.01);同时,IL-6和TNF-αmRNA的表达平也显著降低(P<0.01)。鞘内注射TLR4siRNA也可以显著降低模型大鼠脊髓NF-κB p65、IL-6和TNF-α的表达。结论TLR4/NF-κB信号通路可能参与了大鼠胫骨癌痛的发生和发展。第六部分TLR4/p38MAPK信号转导通路在大鼠胫骨癌痛中的作用目的研究鞘内注射p38MAPK抑制剂4-(4-fluorophenyl )-2- (4-methylsulfonylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole( SB203580)和TLR4siRNA对大鼠胫骨癌痛的作用。方法①荷瘤后4d给予鞘内注射SB203580(2μg/10μl)或5%二甲基亚砜10μl,2次/d,连续3d,末次鞘内注射后6h观察大鼠PWT值和行走痛评分的变化。痛行为学测试后,取大鼠脊髓L4~6,结合第四部分实验标本,免疫组化、western-blot、real time-PCR检测p38MAPK表达的变化;real time-PCR检测IL-1β和TNF-α水平的变化。结果鞘内注射SB203580可缓解大鼠的机械痛超敏和自发痛;并且能显著降低模型大鼠脊髓的p38MAPKmRNA的表达和蛋白质水平(P<0.01);同时,IL-1β和TNF-αmRNA的表达也显著降低(P<0.01)。鞘内注射TLR4siRNA也可以显著降低模型大鼠脊髓p38MAPK、IL-1β和TNF-α的表达。结论TLR4/p38MAPK信号通路可能参与了大鼠胫骨癌痛的发生和发展。