一、研究背景与目的骨代谢是由成骨细胞(osteoblast,OB)的骨形成与破骨细胞(osteoclast,OCT)的骨吸收形成动态平衡的过程。多种细胞如骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cell,,BMSC)、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞(chondrocyte,)、骨细胞(osteocyte,OC)、淋巴细胞等参与合成和分泌各种细胞因子,协同周围环境的各种信号调节骨形成和骨吸收,以维持骨重构的动态平衡。由于衰老、雌激素缺乏、炎症与药物等因素引起骨吸收大(多)于骨形成,进而引起骨质疏松、关节炎等骨丢失相关疾病。破骨细胞来源于骨髓造血干细胞中的单核/巨噬细胞系,经过各种细胞内外环境因素刺激后,最终分化为成熟的多核细胞,吸附于骨表面负责吸收局部骨组织。破骨细胞的活性受多种细胞因子和激素的调节,其中1997年提出的RANK/RANKL/OPG 轴,即核因子 KB 受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-kappaB,RANK)/核因子 KB 受体活化因子配体(RANK lgand,RANKL)/骨保护素(osteoprotegerin,OPG)系统是目前公认的、调节破骨细胞分化与功能的关键因素,这三者均属于肿瘤坏死因子受体超家族(tumornecrosis factor receptor superfamily,TNFRSF)。RANKL能与表达在破骨细胞或其前体细胞表面的RANK结合,进而活化调节破骨细胞形成的转录因子,从而促进破骨细胞的形成、抑制破骨细胞的凋亡;而OPG是内源性的RANKL拮抗分子,能竞争性地与RANK结合(RANKL结合,从而抑制了 RANKL与RANK的结合,进而)来抑制破骨细胞的形成和功能。RANKL/OPG的比例在骨代谢的调控中,特别是对破骨细胞的形成及其功能的调控,起到至关重要的作用,而调控RANKL/OPG比例的机制和具体的分子机制,以及相应的药物研究也就成为了骨代谢研究的一大热点问题。然而,RANKL及其内源性拮抗分子OPG的表达与分泌,是如何被调控的,其中具体的调控机制如何目前还很不清楚。综上所述,RANK/RANKL/OPG轴的发现,是骨生物学基础理论中的重要突破,而相应的药物也应用于临床,防治骨丢失相关疾病如骨质疏松、关节炎等。RANKL/OPG可在多种细胞中表达,如BMSC、成骨细胞、肥大软骨细胞、B/T淋巴细胞、滑膜成纤维细胞和某些肿瘤细胞。最近的研究证明,B淋巴细胞合成和分泌的RANKL是骨髓腔内RANKL的重要来源,尤其是在炎症或雌激素缺乏的病理条件下。B淋巴细胞分泌表达的RANKL是卵巢切除小鼠破骨细胞的增加和编织骨丢失的重要因素,同时,B淋巴细胞的部分亚群自身也能作为破骨细胞前体,具有分化为破骨细胞的能力。但在B淋巴细胞中,调节RANKL/OPG表达的机制尚不清楚。因此,阐明生理条件和病理条件下调控B淋巴细胞中RANKL/OPG表达的机制及其在破骨发生中的作用,对骨丢失相关疾病的理解和防治具有重要意义。雷帕霉素靶标蛋白 mTOR(the mechanistic target of rapamycin)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。其在体内分别以mTORC1(mTOR complex1)和 mTORC2(mTOR complex 2)两种复合物形式存在。mTORC1 由 mTOR、raptor、mLST8、deptor、PRAS40组成,能应答营养、生长因子、能量和应激等一系列信号来调控细胞代谢、生长、增殖和存活。两种小的GTP酶能介导这些上游信号因子对mTORC1的激活,分别是Rheb和Rags。结节性硬化复合物(tuberous sclerosis complex 1/2,TSC1/2)是mTORC1的上游抑制因子,具有GTP酶活化蛋白(GAP)活性,能使Rheb上的GTP分解变成GDP而失活,TSC1/2的缺失会导致细胞或组织中mTORC1水平维持持续活化的状态。mTORC1是细胞内多种生命过程的核心调节分子。mTORC1信号途径的异常能导致多种病理过程发生,如癌症、糖尿病、炎性疾病和衰老。但作为细胞与机体感受营养、调节代谢的主要信号通路,mTOR通路对骨代谢的调节研究相对较少。最近的研究发现mTOR在成骨、破骨细胞增殖分化中起重要作用,但其结论不一致,调节机制不清楚,且大多数结论是建立在Rapamycin干预及体外的细胞实验。mTOR在RANKL/OPG表达中的作用及其调节机制尚未见报道。我们利用cre-loxp转基因动物系统、药物Rapamycin以及TSC2的siRAN干扰等手段,分别使mTORC1活性在小鼠成骨细胞、软骨细胞、B淋巴细胞中特异性地激活或抑制,在动物与细胞水平证实了 mTORC1在RANKL/OPG表达与分泌,以及破骨形成中的重要作用,并同时,阐明了 mTORC1调节RANKL/OPG表达与破骨分化的机制:mTORC1通过负反馈调节Akt与β-catenin,进而上调RANKL/OPG的比例并促进破骨细胞的分化和功能。我们的实验结果不但为骨代谢调节提出了新观点,为骨丢失相关疾病防治提供新思路,而且建立了 mTORC1与β-catenin两条细胞内关键信号通路之间新的相互作用和联系。二、研究方法1、应用cre-loxp系统,我们分别构建全身特异性Tsc1敲除小鼠,成骨细胞特异性敲除Tsc1小鼠,软骨细胞特异性敲除Tsc1小鼠,软骨细胞特异性敲除raptor小鼠,B淋巴细胞特异性敲除Tsc1小鼠,。应用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行小鼠基因型的鉴定,用western blot和免疫组化的方法确定敲除效果。2、通过对敲除小鼠进行micro-CT扫描、骨密度分析、破骨细胞计数,检测mTORC1活性异常对小鼠破骨形成的影响。3、通过HE染色、免疫组化分析mTORC1的活性水平对小鼠RANKL/OPG表达水平的影响。4、通过免疫印迹分别检测条件性敲除小鼠的组织的mTORC1活性水平对RANKL/OPG表达的影响,以及可能存在的调控机制。5、通过给予普通C57小鼠雷帕霉素灌胃处理,探讨对mTORC1活性进行抑制后,C57小鼠的骨密度及破骨细胞形成是否发生改变。6、通过体外培养脂肪干细胞细胞系OP9、成骨样细胞系MC3T3-E1、成骨样细胞系MG63、骨细胞系MLO-Y4、原代大鼠间充质干细胞BMSC、原代小鼠头盖骨成骨细胞、原代小鼠B淋巴细胞,分别用mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素处理,检测不同细胞系中RANKL/OPG的表达水平的变化差异;同时检测p-Akt的S473位点和T308位点及Akt下游分子GSK-3β的磷酸化水平的改变。7、通过体外培养Tsc2基因缺失的小鼠胚胎成纤维细胞系MEFTSC2+/+和MEFTSC2-/-,检测在mTORC1过度活化的情况下,RANKL/OPG的表达水平的变化差异。8、通过特异性的siRNA体外敲低间充质干细胞的Tsc2的表达,检测在骨髓间充质干细胞中mTORC1过度活化时,RANKL/OPG的表达水平的变化。9、通过用DN-Akt腺病毒体外感染间充质干细胞,同时给予一定浓度雷帕霉素药物处理一定时间,检测RANKL/OPG、β-catenin的蛋白表达水平以探讨Akt的活性受到抑制时,mTORC1对β-catenin/RANKL/OPG的调控情况。10、通过用携带catenin基因的质粒和特异性靶向Tsc1基因的siRNA共同转染间充质干细胞,一定处理时间后检测β-catenin/RANKL/OPG的蛋白表达水平是否存在差异,探讨catenin过表达能否抵抗mTORC1过度活化对RANKL/OPG的调控作用。11、通过特异性靶向β-catenin的siRNA体外转染间充质干细胞,同时给予一定浓度的雷帕霉素处理一定时间;以及取原代raptor基因敲除的成骨细胞,用雷帕霉素同时进行药物处理,分别检测RANKL/OPG的蛋白表达变化,探讨mTORC1对RANKL/OPG的调控作用是否通过β-catenin。12、鉴于mTORC1是感应营养信号的关键分子,我们通过给予细胞血清饥饿糖饥饿的刺激,进而检测β-catenin、RANKL/OPG、p-Akt的蛋白表达水平。三、研究结果1、mTORC1活性与RANKL表达、破骨细胞形成、骨丢失密切相关C57小鼠进行卵巢切除术建立骨质疏松动物模型,并强饲mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素,体内研究mTORC1活性与破骨形成之间的关系。microCT检测与分析整体骨量变化(松质骨+皮质骨)发现,持续一个月每天灌胃给予mTORC1抑制剂雷帕霉素的去卵巢组与去卵巢组相比,发现雷帕霉素能显著减缓去卵巢引起的骨丢失:各种骨参数包括骨密度(bone meniral density,BMD)(p=0.326)、骨小梁体积占骨组织总体积的百分比(BV/TV)(p=0.602)、骨小梁厚度(Tb.Th)(p=0.903)、骨小梁数量(Tb.N)(p=0.021)、骨小梁间距(Tb.Sp)(p=0.031)都得到不同程度的改善。我们进一步检测以上动物标本,组织切片免疫组化染色能发现雷帕霉素在抑制mTORC1活性,下调p-S6(S235/236)水平的同时,能抑制骨内RANKL的表达;抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)计算单位骨表面周长的破骨细胞数量与去卵巢组相比显著减少(p=0.000),明显抑制破骨细胞数量。以上数据均通过统计学检验方法检验,并具有显著性差异,P=0.000。以上结果提示:mTORC1活性与RANKL表达、破骨细胞形成和骨丢失密切相关。2、mTORC1调控多种细胞表达RANKL/OPG的水平雷帕霉素通过下调RANKL/OPG的比例,抵抗去卵巢引起的骨丢失,这提示我们mTORC1活性对破骨细胞发生发展及活性具有重要作用。为了确定mTORC1在RANKL/OPG平衡中的作用,我们运用抑制剂或基因敲除/过表达的手段对多种可表达RANKL/OPG的细胞进行处理,检测RANKL/OPG的表达。间充质干细胞(bone marrow stem cells.BMSC)、头盖骨细胞(calvarial osteoblasts,OB)、小鼠骨细胞MLO-Y4细胞系、小鼠成骨样细胞MC3T3-E1、小鼠BMSC细胞系、小鼠脂肪干细胞OP9细胞系分别用雷帕霉素处理,检测发现这些细胞RANKL的mRNA和蛋白的表达水平都显著下降;另外,对永生胚胎成纤维细胞系MEF-TSC2+/+、MEF-TSC2-/-,或用TSC2 siRNA干扰间充质干细胞BMSC,或用取自成骨细胞(OSX-CRE)特异性敲除TSC1或raptor基因的头盖骨细胞体外培养,收集细胞后分别检测RANKL的表达,发现TSC1/2敲除或knockdown使mTORC1活化的同时,显著上调RANKL、下调OPG的mRNA与蛋白质水平;相反,Raptor敲除则抑制mTORC1,并显著下调RANKL、上调OPG的mRNA与蛋白质水平。因此,我们利用mTORC1抑制剂与遗传突变模型证实,在多种细胞中mTORC1促进RANKL、抑制OPG的mRNA与蛋白质表达。3、mTORC1通过Akt调节β-catenin的mRNA稳定性为进一步探讨mTORC1调控RANKL/OPG表达的分子机制,我们分别对雷帕霉素处理的BMSC和没有药物处理的细胞共同进行了全基因组表达谱芯片检测和分析,筛选到转录因子β-catenin的mRNA表达水平在雷帕霉素处理后发生了显著上调。由于β-catenin是调控成骨细胞分化的重要转录因子,同时也能促进OPG的转录,抑制RANKL的转录。我们通过体内、外实验进行验证,发现当mTORC1受抑制时,伴随着β-catenin的表达水平上调;而mTORC1激活时伴随着β-catenin的下降。有报道指出β-catenin编码是受磷脂酰环己六醇三-激酶(PI3-K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路调控的,Akt的磷酸化能抑制β-catenin的上游抑制因子KSRP从而减少β-catenin的降解。另外,mTORC1及其下游S6K1的活化可负反馈的抑制PI3-K/Akt信号通路。我们的体外实验发现,雷帕霉素能上调Akt的活性并显著增加β-catenin的mRNA稳定性;相反TSC1/2的敲除,mTORC1过度活化则使Akt被抑制,降低β-catenin的mRNA。我们用显著性失活(dominant negative,DN)的Akt腺病毒感染BMSC,发现Akt(DN)可逆转雷帕霉素对β-catenin蛋白水平的上调。因此,这些证据表明:mTORC1可通过负反馈抑制Akt活性,进而抑制β-catenin 的 mRNA 稳定性。4、mTORC1 通过 β-catenin 调控 RANKL/OPG 表达水平我们进一步通过体外细胞实验验证β-catenin介导了 mTORC1对RANKL/OPG表达的调节作用。在BMSC细胞中敲低或过表达β-catenin,都能逆转mTORC1活性改变对RANKL/OPG表达水平的调控。同时,KSRP是降解β-catenin mRNA的泛素连接分子,敲低KSRP能上调β-catenin的表达水平并伴随OPG表达的上调和RANKL表达的下调。因此,以上实验结果证实β-catenin介导了 mTORC1对RANKL/OPG表达的调节。5、在体内,mTORC1调控RANKL/OPG的表达促进破骨形成根据前面的实验结果,我们进一步在体内研究mTORC1对RANKL/OPG的调节在破骨形成中的作用。RANKL能在多种细胞中表达,包括成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞、间质干细胞、淋巴细胞等等。我们应用cre-loxp系统分别成功建立全身细胞可诱导的(CAG-cre)、成骨细胞(osteorix-cre)、软骨细胞(collagenⅡ-cre)、B 淋巴细胞(CD19-cre)特异性敲除TSC1或raptor的转基因小鼠,实现在体成骨细胞、软骨细胞或B淋巴细胞的mTORC1活性过度激活或抑制,进一步检测和验证mTORC1活性对骨丢失的影响,组织切片染色和组织蛋白裂解液免疫印迹发现,不仅成骨细胞的mTORC1过度活化(TSC1基因敲除)能促进RANKL表达,软骨细胞的mTORC1过度活化也能促进RANKL表达。通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)并结合破骨细胞计数,体内证明mTORC1过度活化促进破骨细胞形成;mTORC1活性受抑制时(raptor基因敲除)RANKL的表达水平下调,并使破骨细胞形成减少(CAG-TSC1 与 WT,p=0.000;col-TSC1 与 WT,p=0.000;col-raptor 与 WT,p=0.001;CD19-TSC1与WT,p=0.000)。以上数据均通过统计学检验方法检验,并具有显著性差异,p=0.000。与细胞实验结果相似,这些基因敲除小鼠中,mTORC1活性的改变引起Akt活性与β-catenin表达的相应变化。免疫细胞对骨代谢的影响具有多面性,其中T、B淋巴细胞分泌的多种因子除了能影响骨髓基质细胞、成骨细胞,还能对破骨细胞的活性、功能甚至来源补充具有重要作用。我们发现B淋巴细胞敲除TSC1基因的小鼠骨组织会表现出骨丢失与骨质疏松症的表型,组织切片染色和破骨细胞计数都都表现随着B淋巴细胞mTORC1活性的增强,破骨细胞增多并使RANKL的表达水平上调。说明mTORC1除了对成骨细胞、软骨细胞的RANKL表达具有调控作用,也能调控B淋巴细胞的RANKL表达。通过这些基因敲除小鼠模型,我们进一步证实:mTORC1可在动物体内调节Akt/β-catenin信号与RANKL/OPG的表达,进而促进破骨细胞形成。6、图解说明mTORC1在各种表达RANKL的细胞中调节RANKL表达的能力和在破骨形成中的分子机制。最后,我们用图解说明了 mTORC1活性在调节RANKL/OPG表达比例中的开关作用:mTORC1活化时(mTORC1 on)能通过抑制Akt活性与下调β-catenin表达来增加RANKL在各种细胞中的表达,促进破骨细胞形成和骨丢失;mTORC1受抑制时(mTORC1 off)能通过上调Akt/β-catenin来降低RANKL在各种细胞中的表达水平,抑制破骨细胞形成和骨丢失。四、结论1、正常的mTORC1活性是维持骨代谢平衡所必需的,mTORC1的激活可促进RNAKL、抑制OPG表达,进而促进破骨细胞形成与骨丢失。2、mTORC1通过负反馈抑制Akt活性,降低β-catenin mRNA稳定性与下调β-catenin蛋白质表达,进而升高RANKL/OPG比例,促进破骨细胞形成与骨丢失。3、本研究不但建立了 mTORC1与β-catenin两条细胞内关键信号通路之间新的相互作用和联系,而且为破骨细胞形成与骨代谢提出了新的调节机制,也为骨丢失相关疾病防治提供了新思路。