背景乳腺癌发病率是女性恶性肿瘤的第二位,尽管通过早期筛查和综合治疗提高了乳腺癌的生存率,但乳腺癌患者还是因对放疗和化疗的抵抗性及复发和转移而死亡,其中复发及转移成为主要死亡原因。因此,研究乳腺癌治疗的新靶标及新的靶向抗癌药物,防止乳腺癌复发和转移成为抗癌研究的重要课题,而肿瘤干细胞的发现为研究新的抗癌药物提供了新的思路。肿瘤干细胞是存在于癌组织或癌细胞系中,具有特殊表面标志的细胞亚群；少量肿瘤干细胞就可以在免疫缺陷小鼠形成瘤体,相反,非肿瘤干细胞的肿瘤形成能力则较弱。肿瘤干细胞有自我更新和分化两大特征。肿瘤干细胞的自我更新是指肿瘤干细胞通过非对称分裂形成一个和父代肿瘤干细胞完全一样的肿瘤干细胞的过程；肿瘤干细胞的分化是指肿瘤干细胞通过分化形成肿瘤组织中的其他各种类型肿瘤细胞的过程。近年的研究表明,肿瘤干细胞对化疗与放疗有抵抗性,放疗和化疗后残留在肿瘤组织中的肿瘤干细胞是肿瘤复发的原因,并且肿瘤干细胞还参与肿瘤的转移。5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine, DAC)是胞苷类似物,有抑制DNA甲基化的作用。美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)已批准DAC可用于骨髓增生异常综合征和髓性白血病治疗,但DAC对实体瘤也有抗癌效果,初步临床试验表明,DAC对乳腺癌和非小细胞肺癌等有一定抗肿瘤作用。DAC抗癌机制还不很明确,大致包括依赖于DNA去甲基化作用和不依赖于DNA去甲基化作用两方面。前者是指DAC抑制癌细胞的DNA甲基转移酶,使DNA去甲基化,从而使因启动子区域DNA甲基化而静默的基因,尤其是静默的抑癌基因表达；后者是则包括DAC导致癌细胞DNA损伤等。尽管对某一基因来说,其启动子区域的去甲基化作用导致基因表达,但也有研究报道,DAC可下调某些基因的表达,但机制不祥。由于DAC对DNA甲基化的抑制作用,因此把DAC称为表观遗传抗癌药；组蛋白去乙酰化酶抑制剂也属表观遗传抗癌药,其作用主要通过抑制组蛋白去乙酰化酶活性而起抗癌作用。有研究报道,组蛋白去乙酰化酶抑制剂可抑制胚胎癌细胞的干性基因表达,这一研究结果提示,表观遗传抗癌药物可能作为一种靶向肿瘤干细胞的潜在药物用于肿瘤治疗。因此,本研究中,我们首先观察了DAC对乳腺肿瘤干细胞自我更新的影响,然后研究了DAC对乳腺肿瘤干细胞抑制的机制。目的研究DAC对不同乳腺癌细胞系中肿瘤干细胞自我更新的影响；研究DAC对肿癌干细胞系自我更新抑制的相关机制。方法一、乳腺癌细胞系的贴壁培养MDA-MB-468贴壁培养在DMEM基础培养基；SK-BR-3贴壁培养在RIM1640基础培养基；MDA-MB-23I贴壁培养在L-15基础培养基。所有培养基均添加10%的FBS和双抗。细胞长到覆盖70%培养表面时,用用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞,终止消化后制成单细胞悬液用于悬浮培养。二、乳腺癌细胞初级细胞球的培养、DAC处理及初级细胞球形成率的计算贴壁培养的MDA-MB-468、SK-BR-3和MDA-MB-231细胞制成细胞悬液,计数细胞,用15ml离心管1000转／分离心5min收集细胞,用1×PBS洗细胞一次,再离心收集细胞,最后用干细胞培养基重悬细胞,调整细胞浓度至25000个细胞/ml。干细胞培养基配方如下：DMEM/F12=1:1基础培养基,添加2%B27,20ng/mlEGF,10ng/mlbFGF。乳腺癌细胞初级细胞球的培养：将重悬于干细胞培养基、细胞密度为25000个细胞/ml的乳腺癌细胞加于康宁24孔超低粘附培养板上,每孔加细胞悬液0.5ml用于细胞球照相及计数,用于初级细胞球CD44+/CD24-细胞百分比检测；总RNA提取及免疫印迹的初级细胞球培养在6孔超低粘附培养板,每孔加细胞悬液1ml培养液,细胞密度为25000个细胞/ml；于细胞培养的当天起,加100nmol/L和500nmol/L的DAC于干细胞培养基中处理细胞,以01.%DMSO加于干细胞培养基中作为对照,每天添加同样浓度DAC或DMSO于干细胞培养基直到第七天,其间,在第三天更换新鲜干细胞培养基,于培养的第7天,在显微镜下对悬浮培养的细胞照相,并计数直径在40gm以上初级细胞球的数目。初级细胞球形成率=初级细胞球的数目／接种细胞数目×100%。三、肿瘤干细胞自我更新能力的检测肿瘤干细胞自我更新能力以次级细胞球球形成率和初级细胞球中CD44+/CD24-细胞的百分比来衡量。1.次级细胞球的培养及次级细胞球形成率的计算：800g离心1分钟收集乳腺癌细胞初级细胞球,用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞球15分钟,用10%FBSDMEM/F12终止消化,吹打三次分散细胞,用40μm细胞筛网过滤,取滤过的单个细胞,离心1000转／分钟5min收集细胞,用不含FBS DMEM/F12洗细胞一次,离心,用新鲜配制的干细胞培养基重悬,细胞终浓度为25000个细胞/ml,将细胞在康宁24孔超低粘附培养板悬浮培养,每孔加细胞悬液0.5ml,第三天更换一次新鲜培养基,连续培养七天。在显微镜下对悬浮培养的细胞照相,计数直径在40μm以上次级级细胞球的数目。次级级细胞球形成率=次级细胞球的数目／接种细胞数目×100%。2.流式细胞仪检测初级细胞球中CD44+/CD24-细胞百分比取0.1%DMSO,100nmol/L DAC和500nmol/L DAC处理七天的乳腺癌细胞悬浮培养物,离心获得初级细胞球；初级细胞球的消化及单个化初级细胞球细胞的获得同上；细胞用含1%FBS及双抗的PBS洗一次,以1x106/100μl的密度重悬细胞,并加FITC-CD24和PE-CD44或者相应的同种血清对照,在黑暗中孵育40分针。标记的细胞用细胞洗液洗涤,用含1%多聚甲醛固定,然后在流式细胞上分析CD44+/CD24细胞的百分比。四、细胞凋亡的检测初级细胞球用胰酶消化获得单个细胞,用Annexin-V法在流式细胞仪检测乳腺癌细胞球细胞的凋亡。五、总RNA的提取与定量PCR乳腺癌初级细胞球细胞总RNA用Trizol试剂提取,用定量PCR技术检测Nanog, Oct4, Sox2基因在mRNA水平的表达；六、免疫印迹乳腺癌初级细胞球细胞用RIPA细胞裂解液裂解,提取细胞的总蛋白,用免疫印迹检测初级细胞球细胞Nanog蛋白的表达量。结果一、DAC对乳腺癌干细胞自我更新的影响1.DAC对乳腺癌初级和次级细胞球形成的影响：用100nmol/L和500nmol/L DAC处理三种悬浮培养的乳腺癌细胞MDA-MB-231, MDA-MB-468和SK-BR-3,以0.1%DMSO作为对照。对照组、100nmol/LDAC和500nmol/L DAC处理组初级细胞球形成率分别是：MDA-MB-231:49.68±5.13%,43.68±4.63%,31.68±2.21%(F=23.940, P=0.0005); MDA-MB-468:11.43±2.37%,9.32±0.77%,8.44±0.74%(F=5.241, P=0.001); SK-BR-3:10.68±0.54%,8.64±0.98%,7.46±1.01%(F=17.52, P=0.0003)。经统计分析,500nmol/L处理组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),在MDA-MB-231细胞,100nmol/L DAC处理组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),但在MDA-MB-468和SK-BR-3细胞,对照组、100nmol/L和500nmol/L DAC处理组次级细胞球的形成率分别是：MDA-MB-231:68.08±3.41%,47.28±4.01%,37.70±3.40%(F=92.15,P=0.0002);MDA-MB-468:23.72±2.08%,17.52±2.98%,8.44±2.75%(F=42.65, P=0.0001); SK-BR-3:18.84±1.67%,13.50±0.97%,6.76±0.47%(F=51.60, P=0.0001);数据经统计分析,与对照组相比,DAC两个浓度处理的三个乳腺癌细胞系次级细胞球形成率都明显降低,差异具有统计学意义。DAC抑制乳腺癌干细胞次级细胞球的形成率,说明100nmol/L和500nmol/L DAC都能够抑制乳腺肿瘤于细胞的自我更新。2.DAC对乳腺癌细胞初级细胞球中肿瘤干细胞数目百分比的影响：CD44+/CD24-是乳腺肿瘤干细胞的表面标志,为了进一步确认DAC对乳腺癌干细胞自我更新的抑制作用,用流式细胞仪检测了初级细胞球中乳腺肿瘤干细胞CD44+/CD24"百分率。对照组、100nmol/L和500nmol/L DAC处理组初级细胞球细胞中CD44+/CD24细胞亚群的百分比分别是：MDA-MB-231,61.46±5.60%,45.60±2.56%,38.45±2.34%(F=28.75, P=0.0008); MDA-MB-468,7.00±0.70%,2.50±0.50%,2.10±0.24%(F=83.54, P=0.0001); SK-BR-3,10.93±2.08%,3.83±0.41%,3.37±0.46%(F=34.35, P=0.0005)。在三个乳腺癌细胞系,100nmol/L和500nmol/L DAC两个浓度处理组肿瘤干细胞百分比都比对照组低,差异均具有统计学意义。由于初级细胞球中肿瘤干细胞／祖细胞比列高,这一结果提示,DAC能抑制乳腺肿瘤干细胞的自我更新或诱导肿瘤干细胞凋亡。二、DAC对乳腺癌初级球细胞凋亡的影响DAC降低初级细胞球乳腺肿瘤干细胞的百分比的机制可能包括几种可能性：1.只抑制自我更新；2.只诱导凋亡,3.同时抑制自我更新和诱导凋亡；为进一步研究DAC降低初级细胞球乳腺肿瘤干细胞的百分比的机制,我们用AnnexinV法在流式细胞仪检测了两个浓度DAC对乳腺癌细胞球细胞凋亡影响。三个乳腺癌细胞细胞系初级细胞球细胞对照组、100nmol/L和500nmol/L处理组细胞凋亡的百分率是：MDA-MB-231:3.58±0.18%,3.61±0.36%,8.01±0.49%; MDA-MB-468:1.53±0.15%,1.56±0.11%,3.12±0.21%; SK-BR-3:1.50■0.28%,1.66±0.20%,4.01±0.17%.100nmol/LDAC处理组与对照组相比,差异无统计学意义,100nmol/L DAC处理不引起乳腺癌初级细胞球细胞凋亡百分率的增加；500nmol/L DAC处理组与对照组相比,差异有统计学意义,500nmol/L DAC处理组导致乳腺癌初级细胞球细胞凋亡百分率增加。这一结果表明：100nmol/LDAC降低初级细胞球中肿瘤干细胞的百分比与细胞凋亡无关,而与DAC抑制肿瘤干细胞的自我更新有关；500nmol/LDAC降低初级细胞球中肿瘤干细胞的百分比与细胞凋亡和自我更新抑制有关。三、DAC对乳腺癌初级细胞球Nanog, Oct4, Sox2表达的影响1.DAC对乳腺癌初级细胞球Nanog、Oct4和Sox2mRNA表达的影响：肿瘤干细胞自我更新的维持依赖于核心于性转录因子Nanog, Oct4和Sox2的表达。DAC对乳腺癌自我更新的抑制作用机制究竟如何呢?为回答这一问题,我们研究了100nmol/L DAC对乳腺癌初级细胞球Nanog、Oct4和Sox2mRNA表达的影响,发现100nmol/L DAC均可下调MDA-MB-231, MDA-MB-468和SK-BR-3初级细胞球细胞Nanog和Oct4mRNA的表达,但不能下调三个细胞系初级细胞球细胞Sox2mRNA的表达。2.DAC对乳腺癌细胞初级细胞球Nanog蛋白表达的影响：我们选择性进一步观察了DAC对乳腺癌细胞球中Nanog蛋白表达的影响.结果表明,100nmol/LDAC可以下调MDA-MB-231、MDA-MB-468和SK-BR-3乳腺癌干细胞Nanog蛋白的表达。结论1.DAC可以抑制乳腺肿瘤干细胞自我更新。低浓度100nmol/L DAC和高浓度500nmol/L DAC都可抑制乳腺肿瘤干细自我更新。低浓度DAC只对肿瘤干细胞自我更新有抑制作用,而不诱导肿瘤干细胞凋亡：高浓度DAC对肿瘤干细胞自我更新有抑制作用,同时诱导肿瘤干细胞凋亡。2.DAC下调乳腺癌初级细胞球Nanog, Sox2, Oct4的mRNA和蛋白质的表达,提示DAC下调乳腺肿瘤干细胞Nanog, Sox2, Oct4的表达。综上所述,低浓度抗肿瘤药DAC可以抑制乳腺癌干细胞的自我更新,提示使用低浓度DAC就能靶向肿瘤干细胞而达到治疗效果,肿瘤干细胞Nanog可能是治疗乳腺癌的一个新靶标。