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第一部分糖氧剥夺诱导培养的皮层神经元细胞周期再进入及凋亡机制的研究目的:观察糖氧剥夺处理后培养的皮层神经元细胞周期再进入和神经元凋亡情况,探讨糖氧剥夺诱导神经元凋亡的可能机制。方法:建立体外培养的皮层神经元糖氧剥夺(Oxygen-glucose deprivation, OGD)损伤实验,分为对照组、OGD1h后恢复正常培养6h、12h、24h组、roscovitine干预组。应用流式细胞仪检测神经元凋亡,免疫荧光细胞化学染色观察神经元BrdU摄取、磷酸化Rb蛋白(p-Rb,ser 795)表达及其与TUNEL染色的关系;利用western blot检测神经元p-Rb和E2F1的表达情况。结果:与对照组相比,OGD1h恢复正常培养6h、12h、24h组神经元BrdU摄取的细胞比例、TUNEL染色的细胞比例和两者共定位比例依次增高;p-Rb的表达在OGD后各组均明显增高,与BrdU摄取相平行;p-Rb与TUNEL共定位表达在OGD后6h和12h明显,24h共定位细胞比例显著下降;给予roscovitine干预后,OGD处理的神经元p-Rb和E2F1的表达减少,凋亡神经元比例下降。结论:糖氧剥夺后神经元尝试通过Rb磷酸化再进入细胞周期,并诱导神经元凋亡,抑制Rb磷酸化减少OGD处理后神经元的凋亡;磷酸化Rb介导的凋亡途径可能是OGD诱导的神经元凋亡机制之一。第二部分磷酸化Rb蛋白与大鼠局灶性脑缺血后神经元凋亡关系的研究目的:观察大鼠局灶性脑缺血后磷酸化Rb蛋白(p-Rb,ser 795)的表达、定位及其与神经元凋亡的时空关系。方法:制备大鼠大脑中动脉梗塞(MCAO)模型,分为假手术对照组、缺血1小时再灌注12h, 1d, 3d, 7d组。利用TUNEL法检测缺血周边区神经元凋亡情况;免疫荧光组织化学染色方法观察MCAO后各时间点p-Rb的表达与定位;TUNEL与p-Rb荧光双标观察神经元凋亡与p-Rb表达、定位的关系。结果:与对照组相比,大鼠MCAO再灌注12h缺血灶周边开始检测到凋亡细胞,神经元内p-Rb表达增加,部分细胞胞核胞浆均有p-Rb表达;再灌注1d大部分神经元p-Rb从胞核转移到胞浆,TUNEL阳性细胞数达到高峰;再灌注12h和1d, TUNEL与p-Rb分别以重叠和镶嵌的方式共定位;再灌注3d, 7d发生p-Rb核浆转移的神经元与TUNEL染色细胞仍然分别维持在高水平,但是两者却没有明显的共定位关系。结论:p-Rb可能参与短暂局灶脑缺血后神经元早期凋亡过程,间接或者不参与神经元晚期凋亡过程。第三部分流式细胞仪分选thy1-GFP-J转基因小鼠皮层及海马神经元目的:建立一种快速高效获得活体哺乳动物脑内单一纯化神经元群的方法。方法:用RT-PCR和激光共聚焦显微镜扫描脑片鉴定thy1 -GFP-J转基因小鼠(神经元内转入绿色荧光蛋白),取2月龄鉴定阳性小鼠皮层和海马组织,应用番木瓜蛋白酶分离系统制备脑组织单细胞悬液,PI标记死亡细胞,流式细胞仪荧光激活细胞分选技术(FACS)分选收集GFP~+和PI~-的存活神经元,并抽提获得细胞的RNA和蛋白。结果:阳性转基因小鼠DNA的PCR扩增鉴定显示为内参(324bp)和所转基因(173bp)两条带,脑片的激光共聚焦扫描结果显示海马和皮层均可见大小较均一的圆点状绿色荧光。经FACS分选后的细胞几乎全都发出绿色荧光,每次产量约为0.5-1×10~6个存活神经元。获得的纯化神经元中抽提的RNA和蛋白可用于RT-PCR和western blot检测。结论:利用FACS可以从thy1 -GFP-J转基因小鼠脑内获得单一纯化的存活神经元群。该技术的应用将为活体神经元细胞特异性的基因表达和蛋白定量分析研究提供一个可行方案。