第一部分下调HK2基因对对三阴性乳腺癌放疗疗效影响的体外研究目的:己糖激酶2（Hexokinase 2,HK2）,其作为糖酵解途径中的第一个关键（限速）酶,控制着肿瘤细胞的能量代谢。HK2在多种肿瘤细胞及细胞系中高水平表达,通过多种途径参与肿瘤的增殖、侵袭、转移及放化疗敏感性。靶向HK2改善肿瘤治疗效应已经显示出较好的临床应用前景,提示HK2可能是改善肿瘤治疗敏感性的潜在治疗靶点。而三阴性乳腺癌（TNBC）作为一种恶性程度很高的肿瘤,HK2是否可以作为改善TNBC放疗敏感性的潜在靶点有待进一步研究。本部分实验旨在体外研究通过慢病毒介导的下调HK2在TNBC细胞放疗中的敏感性的影响。方法:构建慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）,干扰乳腺癌MDA-MB231细胞,研究沉默HK2基因与乳腺癌细胞MDA-MB231放射治疗敏感性之间的关系。包括HK2 shRNA慢病毒载体的构建、CCK-8实验、细胞流式实验、细胞克隆实验。构建慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）:由上海汉恒公司设计的1个沉默HK2的shRNA基因序列（HK2 shRNA）、1个阴性对照的shRNA序列（Negative shRNA）,然后将沉默HK2的shRNA基因序列和阴性对照的shRNA序列分别与质粒连接,随后转染至人293T细胞,将目的基因转入慢病毒载体中,最后转染入乳腺癌MDA-MB231细胞系;通过抗生素Puromycin筛选获得低表达HK2基因的乳腺癌细胞系。应用RT-PCR及western blotting方法分别从mRNA和蛋白水平检测转染后的沉默效果。CCK-8实验:将MDA-MB23 1细胞分为空白组（Control）、阴性对照组（shNC）和沉默组（shHK2）,监测三组细胞在不同时间点0、24h、48h、72h的OD值,同时将三组细胞分别置于0、2、4、6、8Gy的X线下照射,通过酶联免疫检测仪检测出每组细胞的吸光度,计算得到每组细胞不同剂量下的细胞存活率。细胞流式实验及细胞克隆形成实验:将三组细胞培养后置于4Gy X线剂量下照射,利用流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）中的Annexin V/PI双染法监测细胞凋亡情况,通过细胞平板克隆实验监测细胞增殖情况。结果:构建带有HK2沉默基因的序列质粒pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro,将质粒转染至乳腺癌MDA-MB231细胞内,加入带有绿色荧光（GFP）的嘌呤霉素在显微镜下筛选出转染效率最高的细胞株。并通过RT-PCR及western blotting等实验进一步验证转染效率。在400倍显微镜下观察,大约有90%的细胞被成功感染了慢病毒。RT-PCR及western blotting结果显示,HK2信使RNA和HK2蛋白的表达量均显著下降（P＜0.01）,差异具有统计学意义。CCK-8的实验结果显示,shHK2组细胞活力呈下降趋势,且呈时间和剂量依赖性,三组细胞分别在0、2、4、6、8Gy的X线照射后,三组细胞的存活率在同一个剂量下shHK2组要明显低于Control组和shNC组（P＜0.05）;并且,随着照射剂量的逐渐增高,三组细胞的存活率也逐渐下降,且shHK2组下降的幅度更大。细胞克隆形成实验结果显示:0G时及4Gy时,沉默HK2表达可以抑制三阴性乳腺癌MDA-MB231细胞的克隆形成能力,shHK2组与Control组和shNC组比较,有统计学差异（P＜0.01）。细胞凋亡实验结果显示,shHK2组与Control组及shNC组比较,细胞凋亡率明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论:体外试验中,通过慢病毒介导的RNA干扰技术下调HK2基因的表达,通过CCK-8、细胞克隆实验及流式细胞技术证明了下调HK2增强了 TNBC对放射治疗的敏感性。第二部分 PET/CT评价下调HK2基因对三阴性乳腺癌放疗疗效影响的体内研究目的:利 用 18F-FDG（2-[18F]-fluoro-2-deoxy glucose）和18F-FLT（18F-fluorothymidine）PET/CT（Positron Emission Tomography/Computed Tomography）监测下调HK2对TNBC放疗的疗效;探讨18F-FDG与18F-FLT在TNBC早期放疗疗效中的应用价值;病理组织学检测放射治疗后TNBC组织生物学改变。方法:1.研究沉默HK2基因对裸鼠MDA-MB231模型放射敏感性的影响,以肿瘤的生长体积变化及裸鼠生存期为荷瘤鼠治疗疗效评估指标。将荷瘤鼠随机分为四组:阴性对照组（shNC组）、放疗组（shNC+IR组）、沉默组（shHK2组）和沉默联合放疗组（shHK2+IR组）。在裸鼠腋下构建MDA-MB231肿瘤模型,每组各6只裸鼠,等到裸鼠肿瘤体积长到6-7mm时,将荷瘤鼠置于2Gy剂量的X线下照射,共照射5次,累计剂量10Gy,以后每周测量肿瘤的大小,计算肿瘤生长体积,记录裸鼠死亡时间进行生存期分析。2.18F-FDG及18F-FLT micro PET/CT 显像待裸鼠肿瘤直径达6-7mm时,进行放射治疗,2Gy剂量X线照射,共照射5次,累计剂量10Gy,在照射前,照射后1天及7天分别进行18F-FDG及18F-FLT micro PET/CT显像。Micro PET/CT图像分析方法:采用视觉分析方法结合联合半定量分析方法,选取肿瘤放射性摄取最密集层,勾勒出感兴趣区域,计算出肿瘤组织的最大标准摄取值（Maximal standard uptake value of tumor,SUVmax-T）。同时选取同一水平相对的正常肌肉组织,计算出肌肉组织的SUVmax-M,得到肿瘤组织对肌肉组织的摄取比（SUVmax-T/SUVmax-M）,获得TMR值作为疗效评价的指标。3.病理学检测显像结束后,取裸鼠组织进行病理学检测,包括观察肿瘤大体组织,HE染色,免疫组织化学染色,其中免疫组化染色的指标有:Glut-1、Ki67、HIF-1α、P53、caspase-3。4.统计学分析所有数据均以均数±标准差的形式表示。使用SPSS 22.0进行统计分析。采用独立样本t检验检验两组间的差异,采用方差分析比较每组间的差异。多样本之间的比较采用单因素方差分析及t检验,使用Graphpad prism8绘制图表。以P＜0.05时,表示差异有统计学意义。结果:1.抑瘤率及生存期的影响对放疗后的裸鼠持续观察28天,并绘制每组移植瘤裸鼠的生长曲线,结果显示:shHK2组裸鼠肿瘤体积增长的速率要明显慢于shNC组（*P＜0.05）,放射治疗后,shHK2+IR组肿瘤体积增长速率明显慢于shNC+IR组（P=0.0016＜0.01）,差异具有统计学意义。治疗前、治疗后24小时以及治疗后7天,shNC组荷瘤鼠的体积分别为（67.45±2.36,69.49±0.97,109.51±5.85）mm3,shNC+IR 组分别为（65.13±4.58,65.00±4.90,84.03±6.14）mm3,shHK2 组分别为（64.23±5.38,64.78±5.97,86.83±4.44）mm3,shHK2+IR 组分别为（63.27±6.22,63.79±6.26,75.26±6.89）mm3。治疗后24小时,四组肿瘤的体积均无明显变化,与治疗前比较差异均无统计学意义。而治疗后7天,shNC+IR组、shHK2组、shHK2+IR组肿瘤体积均较shNC组低,抑瘤效果明显,特别是shHK2+IR组相比较于其他组,抑瘤率明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。shNC组裸鼠的生存期为27.67±2.7（21～35天）,shNC+IR组裸鼠的生存期为38.03±3.4（28～48 天）,shHK2 组裸鼠的生存期为 39.7±3.2（30～50 天）,shHK2+IR组裸鼠生存期为51.9±4.2（38～64天）,其中shNC+IR组和shHK2+IR组之间差异无统计学意义。Kaplan-Meier生存分析法分析各组荷瘤鼠生存期的差异具有统计学意义（χ2=9.64,P＜0.05）3.18F-FDGPET/CT 显像四组治疗前TMR值差异无统计学意义。阴性对照（shNC）组、放疗（shNC+IR）及沉默（shHK2）组治疗后24h与治疗前TMR值比较,差异无统计学意义,P＞0.05;放疗（shNC+IR）组治疗后7天与治疗后24h 比较,TMR值降低（t=3.75,P=0.03）,TMR降低率为44.07%,差异具有统计学意义;shHK2组治疗后7天与治疗后24h 比较,TMR值降低（t=3.75,P=0.03）,TMR降低率为28.14%,差异具有统计学意义;shHK2+IR组治疗后24h和治疗后7天与治疗前比较,TMR值均明显减低,（P均＜0.01）,TMR降低率分别为32.25%、64.51%,差异均具有统计学意义。7天后单纯放疗组TMR值比单纯沉默组降低的更为明显。且单纯放疗组24h后TMR值比治疗前稍高。四组治疗后,shHK2+IR组ΔTMR值最大,表明联合放疗组效果更好。4.18F-FLT PET/CT 显像四组治疗前TMR值差异无统计学意义。shNC组治疗后24h与治疗前比较无明显变化,7天后,TMR值明显升高,差异有统计学意义,（P=0.023）;shNC+IR组治疗后24h与治疗前比较,7天与24h 比较,TMR值均降低,（P=0.019、P=0.022）;shHK2组治疗后24h与治疗前比较,7天与24h 比较,TMR值均降低,（P=0.049、P=0.003）;shHK2+IR组疗后24h与治疗前比较,7天与24h 比较,TMR值均降低,（P=0.005、P＜0.001）。治疗后24h及7天,四组之间差异均有差异,且差异具有统计学意义。5.肿瘤体积变化治疗前四组荷瘤鼠肿瘤体积未见明显统计学差异（F=0.18,P=0.92）。放疗24h,四组荷瘤鼠的肿瘤体积无明显统计学差异（F=0.26,P=0.86）。放疗后7天,shNC组肿瘤体积明显增大,shNC+IR组和shHK2组肿瘤体积增长比较缓慢,稍增大,而shHK2+IR组肿瘤体积出现缩小。6.病理学结果免疫组化结果示shNC组、shNC+IR组、shHK2组、shHK2+IR组Glut-1的阳性细胞百分比分别为（62.88±6.21、51.56±7.52、49.76±8.89、22.48±6.47）%;Ki67的阳性细胞百分比分别为（76.35±3.23、58.49±4.32、57.83±2.89、27.65±3.67）%;HIF-1α 的阳性细胞百分比分别为（76.47±4.21、60.67±6.52、61.56±5.89、26.65±2.47）%;P53 阳性细胞百分比分别为（53.48±7.35、40.55±6.24、42.78±7.09、20.17±8.47）%。caspase-3 的阳性细胞百分比分别为（24.49±4.35、38.80±5.36、40.78±6.29、68.77±5.40）%。单因素方差分析各生物学指标组间差异均具有统计学意义,两两组间对比结果shNC+IR组、shHK2组各指标无差异,shHK2+IR组Glut-1、Ki67、HIF-1α和P53阳性细胞率低于放疗组,caspase-3阳性细胞百分比高于放疗组。结论:沉默HK2联合放疗能够抑制肿瘤体积的增长并延长荷瘤鼠的生存时间;18F-FDG和18F-FLT PET/CT以肿瘤/肌肉比值（TMR值）为半定量指标监测沉默HK2对乳腺癌荷瘤鼠24h及7天的治疗效果,结果显示:18F-FLT和18F-FDG PET/CT均能够较早期的监测治疗效果,而18F-FLT不受炎性细胞的影响比18F-FDG的时效性更佳。肿瘤生物学指标中Glut-1、Ki67、HIF-1α、P53以及caspase-3蛋白在四组荷瘤鼠中均有不同程度的表达,且这些生物学指标均指向沉默联合放疗组的效果更好,另一方面说明沉默HK2可以增加放疗的敏感性。