系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种经典的自身免疫性疾病,以血清中出现多种自身抗体和多器官受累为主要特征。该病好发于生育年龄女性,临床表现复杂多样,且不能根治,严重危害着广大患者的身心健康。目前,系统性红斑狼疮确切的病因和发病机制尚不明了,近年来越来越多的研究表明,表观遗传学机制,特别是CD4+T细胞基因异常低甲基化在该病的发生发展过程中起着重要作用。DNA甲基化是表观遗传学领域最早发现的、也是研究得最为成熟的DNA修饰现象。一般认为,基因调控序列的DNA甲基化抑制基因转录；反之,DNA去甲基化则激活基因的表达。我们的课题组经过多年研究发现,SLE患者CD4+T细胞中与自身免疫反应相关的CD11a、CD70等基因调控序列DNA甲基化水平异常降低,导致基因过度表达,诱导CD4+T细胞具有自身反应性,杀伤自身巨噬细胞或过度辅助自身B细胞产生大量的自身抗体,从而诱发或加重自身免疫反应。可见,CD4+T细胞中特定基因调控序列病理性低甲基化是致使SLE发病的重要分子机制之一。然而,导致SLECD4+T细胞基因甲基化状态异常的具体机制至今仍未完全阐明。DNA羟甲基化是近年来新发现的一种调节DNA甲基化的方式,该过程的产物——5-羟甲基胞嘧啶作为一种新的DNA碱基修饰形式,被喻为基因组中的“第六种碱基”。DNA中5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)被双加氧酶家族TET (ten-eleven translocation)蛋白进一步氧化,即成为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)。研究表明,5hmC可能参与DNA去甲基化和基因表达调控。一方面,5hmC可能作为中间产物参与主动或被动去甲基化过程；另一方面,5hmC可能通过取代5mC修饰而解除后者所发挥的生物学作用,或自身招募其他效应蛋白来调节基因转录。总之,5hmC对DNA去甲基化和基因表达调控起着十分重要的生物学作用。作为表观遗传学的前沿与热点研究内容,DNA羟甲基化无疑潜藏着许多新的表观遗传特性及信息有待发掘。结合我们前期研究发现的SLE与某些基因调控序列DNA异常甲基化状态及基因调控之间的密切关系,我们推测DNA羟甲基化很可能在SLE的发病过程中扮演着重要角色,或是通过改变DNA甲基化状态、或是通过自身独立的基因调控途径。鉴于目前尚未有任何关于DNA羟甲基化在SLE中的研究及相关信息报道,本课题拟首次通过羟甲基化DNA免疫共沉淀芯片hMeDIP-chip检测5hmC在SLE患者及正常人CD4+T细胞全基因组范围的分布情况,获得SLE CD4+T细胞DNA羟甲基化差异图谱,并进一步探究DNA羟甲基化在SLE自身免疫反应发病机制中的作用,为SLE的诊治寻找有效的新途径并提供理论依据。第一章系统性红斑狼疮CD4+T细胞全基因组DNA羟甲基化谱第一节系统性红斑狼疮CD4+T(?)田胞全基因组DNA羟甲基化图谱目的：研究SLE患者及正常人CD4+T细胞中的DNA羟甲基化状态,探讨DNA羟甲基化在SLE发生发展过程中的作用及机制。方法Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离5例SLE患者和5例正常人的外周血单个核细胞,免疫磁珠分离法获得CD4+T细胞。hMeDIP-chip芯片检测全基因组DNA羟甲基化状态。结果：hMeDIP-chip芯片结果显示,共3083个基因在SLE患者与正常人CD4+T细胞之间存在启动子区DNA羟甲基化水平的不同,其中3030个基因是在SLE患者中表现出DNA高羟甲基化状态,并主要分布在高CpG含量启动子区；共4646个基因在SLE患者与正常人CD4+T细胞CpG岛中存在DNA羟甲基化水平的不同,其中4643个基因是在SLE患者中表现出DNA高羟甲基化状态,且多发生在基因启动子区的CpG岛。GO分析显示羟甲基化异常改变明显的基因多与基因转录调节、细胞代谢、发育等内容相关。KEGG pathway分析显示羟甲基化差异基因多涉及肿瘤、细胞增殖和胚胎发育、TGF-P等相关的信号通路。结论：SLE CD4+T细胞基因启动子区、CpG岛均呈DNA高羟甲基化水平,DNA高羟甲基化状态可能在SLE发生发展中起重要作用。第二节系统性红斑狼疮CD4+T细胞PPARG、MALT1和IRF2BP2基因启动子区DNA羟甲基化水平研究目的：选择PPARG、MALT1和IRF2BP2三个基因在SLE患者和正常人CD4+T细胞中对DNA羟甲基化芯片结果进行验证。方法：选取10例SLE患者和10例正常人作为研究对象,Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,免疫磁珠分离法获得CD4+T细胞,羟甲基化DNA免疫共沉淀法检测基因PPARG、MALT1和IRF2BP2启动子区的DNA羟甲基化水平。结果：与正常对照相比,SLE患者CD4+T细胞中基因PPARG、 MALT1和IRF2BP2的启动子区均表现出DNA高羟甲基化状态(11.695±2.292Vs5.682±1.645,p=0.000；1.838±0.562Vs0.989±0.326,p=0.001；0.194±0.049Vs0.124±0.031,p=0.001)。结论：羟甲基化DNA免疫共沉淀法验证了SLE CD4+T细胞中PPARG、MALT1和IRF2BP2基因启动子区呈高羟甲基化状态,其结果与hMeDIP-chip芯片结果一致。第二章系统性红斑狼疮CD4+T细胞PPARG、MALT1和IRF2BP2基因表达及其与DNA羟甲基化相关性分析目的：研究SLE患者和正常人CD4+T细胞中基因PPARG、MALT1和IRF2BP2的表达水平及其与DNA羟甲基化的相关性。方法：Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离13例SLE患者和13例正常人的外周血单个核细胞,免疫磁珠分离法获得CD4+T细胞,TRIzo1法提取CD4+T细胞RNA, Real-time PCR检测基因PPARG、MALT1和IRF2BP2mRNA表达水平,并对DNA羟甲基化和基因表达进行相关性分析。结果：与正常对照相比,SLE患者CD4+T细胞中PPARG mRNA和MALT1mRNA表达水平显著升高(p=0.001；p=0.001)；SLE患者CD4+T细胞中基因IRF2BP2mRNA表达水平也高于正常对照组,但差异无统计学意义(p=0.332)。相关性分析显示,PPARG和MALT1基因启动子区DNA羟甲基化水平与其mRNA表达水平呈正相关(PPARG:R=0.713, p=0.021; MALT1:R=0.684, p=0.029)。结论：SLE患者CD4+T细胞中基因PPARG、MALT1mRNA表达水平上升,其启动子区DNA高羟甲基化可能是导致此异常改变的关键所在。