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研究目的:DNA-PKcs是DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)复合物中心组分之一,在DNA双链断裂修复通路非同源末端链接中发挥着至关重要的作用,DNA-PKcs的活性受其磷酸化修饰的调节。类泛素NEDD8被证实能响应DNA损伤应答,但它能否以影响DNA-PKcs活性、并通过此途径来调节NHEJ通路?尚不明确。本课题致力于研究NEDD8是否通过直接修饰DNA-PKcs,进而调节非同源末端链接修复通路,改变癌细胞的辐射敏感性,并阐明其机制。研究内容:分析DNA-PKcs和NEDD8在肺癌组织中的表达相关性;确定DNA-PKcs能否发生Neddylation类泛素化修饰,并明确其发生修饰的结构域及关键位点;鉴定介导DNA-PKcs发生Neddylation修饰的关键连接酶;阐明Neddylation修饰对DNA-PKcs磷酸化的调节作用;探讨DNA-PKcs Neddylation修饰对于NHEJ修复效率以及细胞辐射敏感性的影响。研究方法:(1)利用GEO数据库分析肺癌组织中DNA-PKcs与NEDD8的表达相关性;(2)在293T细胞中过表达野生型NEDD8(SFB-NEDD8 wt)和76位甘氨酸突变的NEDD8(SFB-NEDD8 mutant),24h后收集细胞进行Pull-down和Western blotting实验,检测过表达NEDD8对DNA-PKcs以及Ku70和Ku80蛋白翻相关译后修饰的影响;(3)用DNA-PKcs和NEDD8抗体进行Co-IP实验,检测A549细胞内源的NEDD8对DNA-PKcs的修饰;(4)终浓度为3μM的类泛素化抑制剂MLN4924预处理A549细胞1h,然后用DNA-PKcs抗体进行IP实验,检测MLN4924对DNA-PKcs修饰的影响;(5)体外Neddylation实验进一步证明DNA-PKcs可以被NEDD8修饰;(6)在293T细胞中同时过表达SFB-NEDD8 wt和NEDP1或者NEDP1C163S,24h后收集细胞,进行Pull-down和Western blotting实验,检测NEDD8对DNA-PKcs修饰的变化;(7)构建带有Flag标签的DNA-PKcs截断体(A-H),在293T细胞中过表达后利用Flag-IP实验,鉴定NEDD8修饰DNA-PKcs的结构域;(8)将DNA-PKcs激酶结构域中保守的赖氨酸逐个突变,然后在293T细胞中过表达,通过Flag-IP实验以及质谱分析,鉴定DNA-PKcs发生Neddylation修饰的关键位点;(9)将NEDD8第48和60位赖氨酸进行突变,然后在293T细胞中与DNA-PKcs激酶结构域同时过表达,通过Pull-down实验,探讨NEDD8修饰DNA-PKcs依赖的赖氨酸位点;(10)在293T细胞中过表达DNA-PKcs激酶结构域,24h后收集细胞进行IP-MS(免疫共沉淀-质谱)分析,以及si RNA干扰验证实验,确定介导DNA-PKcs发生Neddylation修饰的关键E3连接酶(HUWE1);(11)在293T细胞中过表达NEDD8,24h后,实验组进行10Gy照射,1h后收集细胞进行Pull-down实验和Western blotting实验,探讨IR对DNA-PKcs Neddylation修饰的影响;(12)实验组用终浓度为3μM的MLN4924,以DMSO为对照,预处理A549细胞1h,然后换新鲜培养基,进行不同剂量(2、4、8Gy)照射后,1h收细胞,或者4Gy照射后不同时间点(1、2、4h)收细胞,进行Western blotting实验,检测p-DNA-PKcs(S-2056和T2609)的磷酸化状态;(13)终浓度为3μM的MLN4924和DMSO预处理A549细胞1h后,换成含有终浓度为30μg/ml VP16的新鲜培养基,作用不同时间点(1、2、4、8、12h)后收集细胞,通过Western blotting实验检测DNA-PKcs磷酸化的状态;(14)向A549细胞中转染UBA3、UBE2M和HUWE1的si RNA,48h后,进行4Gy照射处理,收集照后不同时间点的细胞,进行Western blotting实验,检测DNA-PKcs磷酸化状态;(15)A549细胞经DMSO或MLN4924预处理1h后进行照射(4Gy)或不照射处理,照后1h收集细胞,经激光共聚焦实验检测DNA-PKcs在DNA断裂末端的募集情况;(16)DMSO或MLN4924预处理A549细胞1h,进行4Gy照射,收集不同时间点细胞(1、2、4h)提取染色体蛋白,进行Western blotting实验,检测DNA-PKcs在染色体的募集;(17)通过流式细胞术检测A549 sh-NC和sh-HUWE1细胞经4Gy照射后,4h和8h的周期分布情况;(18)通过激光共聚焦实验分析A549 sh-NC和sh-HUWE1细胞系经4Gy照射前后,γH2AX foci的形成情况;(19)在293T细胞中转染对照si RNA或HUWE1 si RNA,或者53BP1 si RNA,24h后再次转染NHEJ修复系统载体,24h后,进行流式细胞术,检测NHEJ修复效率;(20)通过克隆形成实验,分析敲低HUWE1组或对照组的A549细胞对辐射的敏感性。研究结果:通过对GEO数据库中4个芯片数据集共410例肺癌组织表达谱进行分析,我们发现在非小细胞肺癌组织中DNA-PKcs与NEDD8表达水平呈正相关。通过实验研究发现,无论是表达外源的NEDD8还是细胞内源的NEDD8,都可以对DNA-PKcs进行neddylation类泛素化修饰,并且MLN4924可以抑制该修饰作用。在无细胞体系,不存在连接酶的条件下也有接近10%的DNA-PKcs蛋白被NEDD8修饰。细胞过表达野生型NEDP1时,DNA-PKcs的修饰被去除,而突变的NEDP1却不能,说明NEDP1是介导DNA-PKcs去neddylation修饰的酶。通过构建DNA-PKcs截断体以及免疫共沉淀实验,发现NEDD8修饰DNA-PKcs的激酶结构域,进一步通过质谱分析以及点突变实验鉴定到位于DNA-PKcs激酶结构域的第4007位点赖氨酸是发生Neddylation修饰的关键位点,并且NEDD8是通过其60位的赖氨酸成链来修饰DNA-PKcs的。为了找到介导DNA-PKcs发生修饰的连接酶,我们过表达了DNA-PKcs的激酶结构域,并进行质谱实验,鉴定到了有连接酶活性的候选蛋白,进一步通过小RNA干扰实验,发现敲低HUWE1时DNA-PKcs的neddylation修饰受到明显抑制,这说明HUWE1是介导DNA-PKcs发生Neddylation修饰的E3连接酶。随后我们发现经电离辐射诱导DNA损伤后,HUWE1与DNA-PKcs以及UBE2M的相互作用增强,提示可能DNA损伤会诱导DNA-PKcs Neddylation修饰的增强,经验证我们发现在电离辐射诱导DNA双链断裂后,DNA-PKcs发生Neddylation修饰增强,且具有剂量依赖性。随后探讨了Neddylation类泛素化修饰对DNA-PKcs蛋白功能的影响,尤其是其磷酸化状态的变化。我们发现,当分别敲低Neddylation修饰的E1激活酶、E2结合酶以及E3连接酶后,DNA-PKcs第2056位点丝氨酸的磷酸化受到明显抑制,但是其第2609位点的苏氨酸的磷酸化不受影响。进一步研究发现当抑制DNA-PKcs Neddylation修饰,导致其2056位点丝氨酸的磷酸化水平降低,结果DNA-PKcs从DNA断裂末端的脱落也受到抑制。最后我们在敲低HUWE1的细胞系中进行功能试验,发现敲低HUWE1抑制细胞的非同源末端链接修复,造成G1期阻滞,增强癌细胞的放射敏感性。结论:在电离辐射所致细胞DNA双链断裂损伤反应中,HUWE1介导了DNA-PKcs激酶结构域发生neddylation类泛素化修饰,促使DNA-PKcs 2056位点丝氨酸的自磷酸化,促进DNA双链断裂损伤的非同源末端连接修复效率,增强了细胞对放射损伤的抵抗性。