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近年来,随着对杆状病毒研究的深入,其作为一种高效的载体宿主表达系统和基因转移载体,被人们广泛应用于外源蛋白在哺乳动物细胞中的表达,从而显示出作为非复制型载体的应用前景。本课题尝试将WPRE、ITRs、VSVGED三种元件同时加入到杆状病毒中进行遗传修饰和改造,探讨了其对外源基因表达的影响及其进行协同调控的效果。阐明CMV、CBA、EF]-α WSSViel启动子是否可以在哺乳动物细胞和禽类细胞中启动外源基因的表达,探讨启动子的启动效率、作用范围及对象,加深对哺乳动物细胞启动子的了解,这对启动子的研究将具有重要意义。本课题将分别具有CMV、CBA、EFl-α、WSSV iel启动子调控的eGFP报告基因表达盒与pPolH启动子相反的方向插入载体骨架,构建得到对照杆状病毒载体pX-control-eGFP。随后,在eGFP基因的3’非编码区中插入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE,用以增强eGFP基因的表达效率,由此得到重组杆状病毒转移载体pX-WPRE-eGFP。然后依据杆状病毒假型化修饰技术,将杆状病毒pPolH启动子调控的VSVGED表达盒和VSVG表达盒插入载体骨架中。得到第二组重组杆状病毒转移载体pX-eGFP、pX-gv-eGFP。在此基础上,将延长报告基因表达时间的腺联病毒末端反向重复序列(Adeno-associated virus inverted terminal repeats,ITRs)引入启动子调控的表达盒的两端,获得转移载体pX-ITRs-eGFP,与转移载体进行对照来比较ITRs对基因表达时间的影响。载体分别转化至E.coli DH10Bac感受态细胞中,提取重组BacmidDNA,然后转染Sj9昆虫细胞,获得P1代重组病毒,经三次侵染Sj9昆虫细胞后获得高滴度的P3代病毒。将不同组的病毒分别转染Sj9昆虫细胞、CHO-K1细胞和鸡原代细胞,转染48h后,利用倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察eGFP基因的表达。结果表明CMV、CBA、EF1-α、WSSViel启动子均能在CHO-K1细胞和鸡胚成纤维细胞均能启动eGFP基因表达,但是表达强度因不同的细胞系而有差异。在CHO-K1细胞中表达效果依次为CBA>CMV≈EF1-α>iel;而在鸡胚成纤维细胞中表达强度依次为CMV≈CBA>ie1>EF1-α。同过统计分析,WPRE元件对增强杆状病毒表达外源基因有显著效果,与对照组相比在CHO-K1细胞中表达率增加57.69%,在鸡胚成纤维细胞中增加42.89%。VSVGED和WPRE联合作用则在哺乳动物中表达率增加81.65%,在鸡胚成纤维细胞中增加64.90%,作用显著.研究还发现,ITRs元件能有效延长细胞表达eGFP的能力,240h时仍可见强荧光表达。而在Sj9细胞中,ie1启动子有强启动作用,能启动eGFP的表达,表达率随着MOI的增大而增加,在MOI=50时到达最高,随后随着MOI的增大,表达率反而下降。主要是细胞出现病变死亡。而且,在昆虫细胞中,可明显观察到VSVG对细胞的毒害作用,融合现象的发生与病毒的MOI、侵染时间呈正相关。当MOI=50时,表达96h后即可见明显的细胞融合现象,而VSVGED则无毒害作用。本研究将为下一步开发防治禽类新型疫苗奠定理论和实践基础,同时也为防治其他病毒性疾病的非复制型活疫苗开发提供崭新思路和有益借鉴。