手性醇是重要的手性中间体，被广泛用于手性药物、农用化学品、香料和功能材料的合成。对映体纯1—(4—甲氧基)—苯基乙醇(MOPE)是一种重要的手性中间体，(S)—MOPE是合成抗过敏药的重要合成子，而(R)—MOPE则可用来合成3—芳基—3—取代的丙酸类抗炎药物。目前，制备手性醇的方法主要有化学法和生物法两种。其中，化学法条件苛刻，需要使用昂贵的手性试剂才能确保产物的手性纯度，而生物法因其立体选择性高、反应条件温和以及环境友好等优点而备受青睐。生物法催化潜手性酮的不对称还原是制备对映体纯手性醇的首选方法。与离体酶相比，以全细胞为催化剂不仅能利用自身的代谢过程实现辅酶的原位再生，省去辅酶的添加，同时酶和辅酶都被保护在天然的细胞环境中，有利于保持其活性；而且，倘若使用固定化细胞进行催化，不仅有利于产物的分离，还可回收细胞重复使用，大大简化生产工序，降低生产成本。微生物细胞种类繁多，易于培养，底物谱广，可广泛用于各种生物转化过程。因此，本文采用微生物细胞催化对甲氧基苯乙酮(MOAP)不对称还原制备对映体纯MOPE。 目前报道的微生物细胞催化MOAP不对称还原为对映体纯MOPE的反应均在水相中进行，由于逆反应严重，底物和产物不仅对反应有抑制作用，而且对微生物细胞有明显的毒害，导致反应产率和/或产物的对映体过量值(enantiomeric excess，e．e．)不理想。针对以上问题，本文试图通过代谢调控和相转移两种手段来提高反应效率。探讨不同反应介质，尤其是含离子液介质对固定化微生物细胞催化MOAP不对称还原反应的影响规律及其机理，揭示含离子液体介质中固定化微生物细胞催化MOAP不对称还原反应的特性，并以此为基础，创立可望取得自主知识产权的、可用于高效制备对映体纯芳香醇的生物催化反应体系。 在14株供试微生物菌株中，红酵母(Rhodotorula spAS2.2241)和三角酵母(Trigonopsis variabilisAS2.1611)细胞能催化MOAP不对称还原分别生成(S)—MOPE和(R)—MOPE，且均具有较高的立体选择性和产率，适合作为催化MOAP不对称转化为对映体纯MOPE的生物催化剂。在水相中固定化红酵母细胞催化MOAP不对称还原反应的最适缓冲液pH值、反应温度、细胞浓度、底物浓度和振荡速度分别为8.0、25℃、0.32g/mL、5.0mmol/L和150r/min，在上述反应条件下，反应初速度、最大产率及产物e．e．值分别为5.8μmol/h、90.3％和99％。显然，最适底物浓度和最大产率较低，这可归因于水相中严重的产物抑制和逆反应。 鉴于离子液体能改善细胞膜透性，改变底物和产物在细胞内的浓度，本研究试图通过代谢调控途径，向反应体系中添加水互溶的咪唑类离子液体，以期降低胞内的产物浓度，提高反应效率。研究发现，组成离子液体的阴、阳离子类型对固定化红酵母细胞催化MOAP不对称还原反应有较大影响，特定阴阳离子间的匹配对固定化红酵母细胞发挥最佳催化效果至关重要。当组成离子液的阴离子为BF4-和TfO-时，红酵母细胞的催化活性较低；当阳离子为CnMIM+时，随着n值的增加，红酵母细胞的催化活性呈下降趋势；只有当C2OHMIM+和NO3-匹配时，红酵母细胞的催化活性最高，故选择C2OHMIM·NO3为最适离子液体。 在C2OHMIM·NO3-缓冲液混合体系中，固定化红酵母细胞在最适缓冲液pH值、反应温度、离子液C2OHMIM·NO3浓度、振荡速度和底物浓度分别为8.5、25℃、5.0％(v/v)、200r/min和12.0mmol/L时，催化MOAP不对称还原反应的初速度、最大产率和产物e．e．值分别为7.3μMol/h、98.3％和99％以上。其最适底物浓度、反应初速度及最大产率均高于水相体系的对应值。研究表明，离子液C2OHMIM·NO3既能适当增加细胞膜的透性，又能保持细胞膜的正常生理功能，维持细胞催化活性，故能提高该反应的效率。此外，在该反应体系中，固定化红酵母细胞还能成功催化一系列潜手性芳香酮的不对称还原反应，其初速度和最大产率与取代基的电子效应密切相关，所获得的最大产率和产物e．e．值分别为＞96％和＞99％，均高于现有报道的对应值，说明这一反应体系可广泛用于高效合成(S)-型手性芳香醇。 为了进一步提高反应效率，本研究尝试采用相转移的方法，以期利用第二相对底物和产物的萃取作用，降低水相中底物和产物的浓度，从而减轻底物、产物抑制和逆反应。由于有机溶剂/缓冲液是常见的双相反应体系，为此，首先在不同有机溶剂与缓冲液组成的双相体系中进行固定化红酵母细胞催化MOAP的不对称还原反应。不同有机溶剂对固定化红酵母细胞催化MOAP不对称还原反应的影响各异。除十二烷外，随着Log P值的增大，反应初速度和最大产率均逐渐增大。在所研究的有机溶剂中，异辛烷为最适有机介质。在异辛烷/缓冲液双相反应体系中，固定化红酵母细胞催化MOAP不对称还原反应的最适缓冲液pH值、反应温度、两相体积比、底物浓度和振荡速度分别为8.0、30℃、1/2、7.0mmol/L和180r/min；在上述反应条件下，反应初速度、最大产率和产物e．e．值分别为1.4μmol/h、73.0％和＞99％。显然，异辛烷/缓冲液双相反应体系不能有效地提高该反应的效率。试验表明，有机溶剂异辛烷对红酵母细胞的毒性较大，导致细胞的催化活性大大下降。 为解决上述问题，本文采用具有良好生物相容性的新型介质离子液体替代有机溶剂。在所研究的离子液体中，C4MIM·PF6为最适的萃取相。在C4MIM·PF6/缓冲液双相反应体系中，固定化红酵母细胞催化MOAP的不对称还原反应在最适缓冲液pH值、反应温度、两相体积比、底物浓度和振荡速度分别为7.5、25℃、4/1、40.0mmol/L和220r/min的条件下，反应初速度、最大产率和产物e．e．值分别为1.6μmol/h、95.5％和＞99％。与异辛烷/缓冲液双相体系相比，最适底物浓度(7.0mmol/L vs．40.0mmol/L)和最大产率(73.0％vs．95.5％)显著提高。进一步的研究表明，离子液体C4MIM·PF6具有较好的生物相容性，且对底物和产物均具有较高的萃取效率，这很好地说明了C4MIM·PF6/缓冲液为该反应适宜介质的原因。将离子液C4MIM·PF6进行回收，重复使用8批次后，该不对称还原反应的效率基本保持不变。 固定化红酵母细胞在C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中的操作稳定性最佳，其次是C2OHMIM·NO3-缓冲液混合体系，再次是水相体系，在异辛烷/缓冲液双相体系中固定化红酵母细胞的操作稳定性最差。以上现象可用介质的生物相容性及介质对底物、产物在各相中分配的影响之研究结果加以解释。 不同反应介质中红酵母细胞形态的研究表明，当细胞形态正常，固定化红酵母细胞催化MOAP不对称还原反应的催化活性较高，当细胞偏离正常形态，则其催化活性降低。 在所研究的供试菌种中，三角酵母细胞能较高效地催化MOAP不对称还原成(R)-MOPE。在水相中，固定化三角酵母细胞在最适缓冲液pH值、反应温度、细胞浓度、振荡速度和底物浓度分别是8.5、25℃、0.40g/mL、180r/min和5.0mmol/L时，其催化MOAP不对称还原为(R)-MOPE的反应初速度、最大产率和产物e．e．值分别为4.7μmol/h、86.4％和87％。 为提高反应效率，尝试采用不同的反应体系。研究结果表明，在有机溶剂/缓冲液双相体系中，固定化三角酵母细胞催化MOAP不对称还原反应的最大产率(＜29％)和产物e．e．值(＜52％)均低于水相中的对应值；在离子液/缓冲液双相体系中，其最大产率较低(＜57％)，反应效率不高。可见，双相反应体系对该反应的影响与其对红酵母细胞催化MOAP不对称还原反应的影响不同。与红酵母细胞催化MOAP不对称还原反应的情况相似，C2OHMIM·NO3-缓冲液混合溶剂为三角酵母细胞催化MOAP不对称还原反应的适宜介质。在含离子液体C2OHMIM·NO3混合反应体系中，固定化三角酵母细胞催化MOAP的不对称还原反应在最适缓冲液pH值、反应温度、离子液C2OHMIM·NO3浓度、振荡速度和底物浓度分别为8.5、30℃、2.5％(v/v)、200r/min和15.0mmol/L时，其反应初速度、最大产率及产物的e．e．值分别为7.6μmol/h、97.2％和＞99％。与水相体系相比，其最适底物浓度(5.0mmol/L vs．15.0mmol/L)、最大产率(86.4％vs．97.2％)和产物e．e．值(87％vs．＞99％)均大幅度提高。此外，在该反应体系中，固定化三角酵母细胞还能高效催化一系列潜手性芳香酮还原为(R)-型芳香醇，其最大产率和产物e．e．值均远高于现有报道的对应值，说明该反应体系具有较广泛的适用性。 首次通过荧光显微镜观察，发现所研究的离子液体均能进入红酵母和三角酵母细胞内，且含离子液体系中的酵母细胞发射出的荧光随离子液的种类和菌种的不同而异，提示离子液体可能与胞内的醇脱氢酶系相互作用。 本研究不仅有助于丰富对含离子液体介质中生物催化和生物转化的认识，还提供了一条高效制备对映体纯芳香醇的新途径。