近几年来,抗免疫检查点抗体在癌症的临床治疗中获得了前所未有的成功,已经进入以往仅有传统化疗药物的一线用药选择。然而对于抗免疫检查点抗体低反应的大部分患者,由于肿瘤具有较低突变和较少免疫浸润,还是需要寻找新的治疗策略来诱导T细胞针对宿主免疫系统忽略的隐蔽表位产生免疫应答。因此,并不算是新技术的肿瘤疫苗被认为可以承担引发T细胞针对隐性新表位产生免疫应答的任务。尽管肿瘤疫苗的研究时间并不短,但是治疗性癌症疫苗在临床前研究和临床试验中单独使用时都没有特别理想的治疗效果,一个可能的原因就是治疗性癌症疫苗诱导的T细胞免疫应答的范围有限。在课题组前期研究中发现,DRibble肿瘤疫苗具有靶向隐藏的肿瘤抗原表位和增强T细胞免疫的潜力,为了突破治疗性肿瘤疫苗诱导T细胞免疫应答的局限性,我们希望寻找一种方法与DRibble疫苗联用来提高其诱导T细胞免疫应答能力。本研究中我们假设DRibble诱导的T细胞扩增可以通过共同施用共刺激抗体例如抗OX40(CD 134)来加强。同时课题组前期研究中还发现,在小鼠模型中使用MCA诱导并且独立生成各同源肿瘤,DRibble疫苗免疫不仅可以对制备DRibble的肿瘤再冲击产生免疫应答,而且对其他MCA诱导并且独立生成的肿瘤再冲击可以产生同样的免疫反应。这些实验结果提示,DRibble疫苗中包含这些MCA诱导的肿瘤所共享肿瘤抗原表位,面对来自同源但具有不同抗原特性的肿瘤再冲击,可以对DRibble疫苗免疫小鼠产生抗肿瘤交叉保护作用。在本实验中,我们将研究对象从同源但具有不同抗原特性的肿瘤扩展到不同遗传背景小鼠来源的肿瘤,研究异源DRibble疫苗是否可以诱导T细胞免疫应答并产生抗肿瘤效应。目的:采用改变抗原免疫方式及与共刺激分子激动剂联用的方法,探讨DRibble肿瘤疫苗诱导T细胞免疫应答及其抗肿瘤作用的增强策略;并通过DRibble疫苗中的泛素化错误折叠蛋白探讨DRibble疫苗引起肿瘤免疫应答的作用机制。方法:1.采用皮下免疫与淋巴结注射两种不同免疫方式刺激活化CFSE标记的OT-IT细胞并检测其增殖情况;将OX40共刺激分子抗体与DRibble联用刺激OT-IT细胞并测定其表面CD127与KLRG1的表达情况;使用同源的4T1-DRibble疫苗与异源的C57MG-DRibble和MMC-DRibble疫苗淋巴结注射免疫BALB\c小鼠,然后取脾进行体外肿瘤再刺激及DRibble再刺激实验;构建BALB/c小鼠4T1原位乳腺癌模型,用同源或异源乳腺癌DRibble疫苗联合OX40共刺激分子抗体对BALB/c小鼠4T1肿瘤进行免疫治疗,观察肿瘤生长情况及小鼠生存状况,绘制肿瘤生长曲线及生存曲线。2.构建原核表达质粒pUbiG101-Vx3GFP,转化LPS缺陷型BL21(DE3)感受态细菌,挑选单克隆培养,诱导表达后鉴定目的蛋白Vx3GFP,鉴定正确后扩大培养至2L培养基,低温诱导Vx3GFP表达,之后收集菌液离心后得到菌体沉淀,采用三相分离提取法制备蛋白粗提产物,通过Ni-Sepharose excel层析柱纯化Vx3GFP工具蛋白;加入硼替佐米处理肿瘤细胞16-24小时后,制备反复冻融细胞裂解物,与Vx3GFP工具蛋白结合后,加入Ni-Sepharose excel层析柱颗粒,亲和纯化富集肿瘤来源泛素化蛋白。3.取naive C57BL/6小鼠肝组织剪碎后的细胞悬液作为正常组织来源,以及B78H1-GFP及B78H1-OVA-GFP细胞作为肿瘤来源,分离泛素化短寿蛋白并在体外刺激OT-I抗原特异性T细胞增殖;制备同源的泛素化短寿蛋白4T1-SLiPs 和 CT26-SLiPs 与异源的 C57MG-SLiPs,淋巴结注射免疫 BALB\c小鼠后,进行体外肿瘤再刺激,并通过流式细胞仪测定表达IFN-γ的肿瘤特异性T细胞含量;制备来自含有不同MHC-Ia类分子的肿瘤细胞B78H1-Db、B78H1-Kb及B78Hl-DbKb的泛素化短寿蛋白,淋巴结注射免疫C57BL/6小鼠后,体外进行不含MHC-Ia类分子的B78H1肿瘤再刺激,并通过流式细胞仪测定表达IFN-γ的肿瘤特异性T细胞含量。4.从表达gpl00黑色素瘤抗原的Mel-30黑色素瘤细胞中使用Vx3GFP融合蛋白分离了泛素化蛋白,使用体外诱导产生的moDC作为抗原提呈细胞,与由识别HLA-A2限制性gp100表位的黑色素瘤患者肿瘤组织分离的gp100特异性CD8+肿瘤浸润淋巴细胞细胞系(TIL-1520)共培养,18小时后检测IFN-γ+的细胞内染色水平;将来源于UbiLT3或UbiLT3pp65肿瘤裂解物的泛素化蛋白与moDCs共孵育以活化moDCs,然后再将这些负载泛素化蛋白的moDCs与pp65 MHC-I四聚体阳性的CD8+ T细胞共培养,18小时后检测IFN-γ+的细胞内染色水平;使用氧化铝水凝胶佐剂(HS)先与泛素化蛋白结合,再负载于树突状细胞之上,进行pp65特异性T细胞刺激实验;制备总蛋白量相同的PFO渗透产物或反复冻融裂解物,比较二者通过交叉提呈从而刺激人记忆T细胞的能力;从异源肺癌细胞系UbiLT3纯化泛素化蛋白,刺激非小细胞肺癌患者肿瘤组织分离并扩增的具有肿瘤反应性的肿瘤浸润淋巴细胞,测定其分泌GM-CSF和IFN-γ水平。结果:1.采用不经过树突状细胞负载的免疫方式,淋巴结直接免疫DRibble疫苗可以引起比皮下直接免疫高约20倍的OT-I抗原特异性T细胞分裂活化;与OX40共刺激分子抗体联用后,OT-IT细胞占脾细胞百分比比单独DRibble组增高近5倍,并且在T细胞增殖达到峰值当天,单独DRibble组仅表达CD127阳性,而与OX40共刺激分子抗体联用组中KLRG1表达被诱导,从而明显地改变了 T细胞组成;同源或异源DRibble疫苗均可刺激产生4T1肿瘤特异性CD8+效应T细胞,分泌IFN-y的CD8+T细胞中超过70%也产生颗粒酶A或B,表明这些细胞是典型效应/记忆T细胞;同源4T1 DRibble疫苗与OX40共刺激分子抗体联用治疗表现出明显的协同效应,不仅肿瘤生长被明显地抑制,并且60%的小鼠肿瘤被完全清除,与对照组相比其中位生存期得到了显著提高;异源DRibble疫苗也具有刺激机体产生4T1肿瘤特异性免疫反应的能力。2.通过重新设计Vx3(A7)原核表达质粒,将Vx3(A7)改造为GFP融合蛋白(Vx3GFP),并转化LPS缺陷型BL21(DE3)细菌中进行表达,经过优化实验,选择添加0.1mMIPTG并在16℃进行低温诱导作为细菌表达条件,利用三相分离提取法去掉了表达细菌中的大部分杂蛋白,可以成功制备较为纯净的Vx3GFP蛋白粗提产物并进行亲和层析,得到纯化的Vx3GFP工具蛋白;通过加入不同含量的Vx3GFP工具蛋白进行分离,优化Vx3GFP的工作条件,anti-polyUb的Western免疫印迹结果表明10μg Vx3GFP即可有效分离1mg细胞裂解物中的泛素化蛋白。3.初始OT-IT细胞经过CFSE标记后,加入负载泛素化短寿蛋白的mutu-1940 DC刺激,OVA特异性T细胞增殖仅在来源于B78H1-OVA的泛素化短寿蛋白中检测到,而来自B78H1-GFP或正常肝组织细胞的泛素化短寿蛋白均不能刺激活化OT-I T细胞;同源或异源来源的泛素化短寿蛋白刺激产生的CD8+ T细胞均可以对4T1肿瘤体外再刺激产生IFN-γ,并且被泛素化短寿蛋白刺激产生的CD8+ T细胞也可以对CT26大肠癌细胞体外再刺激产生IFN-γ;表达H-2Db、H-2Kb或H-2DbKb的B78H1肿瘤细胞都可以刺激泛素化短寿蛋白诱导的T细胞产生IFN-γ,而原始的B78H1肿瘤细胞不能。4.Mel-30肿瘤细胞裂解物纯化的泛素化蛋白可以活化moDCs从而刺激TIL-1520细胞产生IFN-γ,而从UbiLT3肺癌细胞纯化的泛素化蛋白不能刺激TIL-1520细胞;来源于UbiLT3pp65肿瘤裂解物的泛素化蛋白可以充分活化CD8+和CD4+T细胞从而产生IFN-γ,其刺激活化T细胞的水平类似于或大于作为阳性对照的重组CMV蛋白,而来源于UbiLT3裂解物的泛素化蛋白则完全不能活化pp65 MHC-I四聚体阳性的T细胞;与纯化UbiLT3pp65泛素化蛋白过程中的上柱物、流出物相比,只有富集的泛素化蛋白能够有效刺激CD8+和CD4+T细胞并产生免疫应答;HS氧化铝佐剂与泛素化蛋白结合后可以显着增加产生IFN-γ的CD8+T细胞的百分比,而产生IFN-γ的CD4+T细胞则不受加入的HS氧化铝佐剂影响;由PFO渗透产物诱导产生的IFN-γ+ CD8+ T细胞百分比显著高于反复冻融裂解物诱导产生的百分比,而由这两种抗原诱导产生的IFN-γ+ CD4+T细胞的百分比是相似的;当来源于UbiLT3细胞裂解物的泛素化蛋白负载在自体DC或Mutz-3 DLC上刺激活化TIL-101时,可以明显检测到GM-CSF和IFN-γ的产生。结论:1.淋巴结直接免疫DRibble抗原活化抗原特异性T细胞的程度优于皮下直接免疫方式;同源或异源DRibble疫苗与抗OX40抗体联用后都具有诱导4T1肿瘤特异性效应T细胞的能力,并可介导4T1荷瘤小鼠的肿瘤消退。2.设计构建的Vx3GFP融合蛋白表达质粒可以成功表达并纯化,可以制备大量Vx3GFP工具蛋白;原核表达纯化的Vx3GFP工具蛋白具有生物活性,可以特异性结合肿瘤细胞裂解物中的泛素化蛋白。3.DC负载肿瘤来源的泛素化短寿蛋白后可以刺激抗原特异性CD8+ T细胞活化增殖;肿瘤来源的泛素化短寿蛋白能够有效交叉刺激产生肿瘤特异性T细胞,并且不受MHC-Ia分子限制。4.肿瘤来源的泛素化蛋白可作为交叉提呈抗原的有效底物并活化人肿瘤抗原特异性T细胞;氧化铝佐剂可促进交叉提呈泛素化蛋白至CD8+T细胞;异源肿瘤泛素化蛋白可为从人肿瘤组织分离的TIL提供有效交叉识别的富集抗原。