目的：　　 荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)是非同位素探针标记,监测细胞DNA畸变的一种方法。其原理是将荧光素标记的小DNA片段作为探针与染色体或染色质上与之同源的靶序列进行杂交,杂交之后靶序列也就标记上荧光物质,在荧光显微镜下可以被激发出荧光,根据荧光信号鉴定每个细胞中靶序列的拷贝数,确定探针的位置,继而对染色体数目和结构是否异常进行分析。膀胱肿瘤是泌尿生殖系统最常见的肿瘤,全世界每年约新增病例26万例。在我国男性泌尿生殖系统肿瘤中,膀胱肿瘤的发病率和死亡率均占首位,其死亡率是男性十大恶性肿瘤的第九位。膀胱肿瘤的分期和分级是影响膀胱肿瘤患者术后复发的危险因素,分期分级越高,复发的概率越高。因此,膀胱肿瘤患者早发现、早诊断、早治疗对于降低膀胱肿瘤患者术后复发有着重要的关系。传统上,膀胱镜检查、病变部位活检和尿脱落细胞学检查一直是诊断膀胱肿瘤的金标准,但膀胱镜检查属于创伤性检查,患者痛苦且有导致尿路感染的可能性,难以发现早期病变；尿脱落细胞学的检测虽然特异性高,但敏感性低,尤其是对低分级肿瘤的敏感性更低,而且该方法较为主观且假阴性率较高,影响临床的诊断。令人兴奋的是,国外采用FISH检测膀胱肿瘤患者尿脱落细胞染色体的改变,不但用于膀胱肿瘤的诊断,而且还发现3号、7号、17号染色体非整倍性改变及9号染色体p16位点的缺失与膀胱肿瘤的发生、发展及预后有密切关系。新近国内有些大医院也陆续开展了该项检测。为此,本研究采用FISH技术,观测了36例疑似膀胱肿瘤患者尿液脱落细胞的染色体畸变改变,并与常规脱落细胞学检测和病理组织病理学分级进行了比较,评价FISH对尿脱落细胞检测意义,探究FISH检测与膀胱肿瘤进展及侵袭的关系。　　 方法：　　 1.正常阈值的建立　　 采集20例正常人尿液标本,按照FISH检测实验方法,每组探针观察100个细胞,统计出现不同类型异常情况细胞数目的百分比,建立正常阈值范围,检测值大于阈值(M+3SD),判定为阳性结果；小于阈值,判定为阴性结果。　　 2.标本的收集和前处理　　 收集2008年3月-12月,36例疑似膀胱肿瘤的血尿患者的晨尿标本,其中男性29例,平均年龄65.62±10.37(x±s)岁；女性7例,平均年龄66.86±10.75(x±s)岁。每例患者连续3d留取清晨新鲜中段尿液200ml,1h内送检；尿液经前处理后滴片于玻片上,56℃环境中老化玻片30 min。本实验对前处理进行了预实验,摸索出合适本实验室的最佳实验条件。　　 3.探针的选择与判别　　 用2组DNA探针,一组 CSP3/CSP7分别杂交于3号和7号染色体的着丝粒区域,CSP3荧光信号为绿色(FITC),CSP7荧光信号为橘红色(Rhodamin)；另一组CSP17/GLP p16,GLPp16杂交于9号染色体长臂(9q21),荧光信号为橘红色；CSP17杂交于17号染色体的着丝粒区域,荧光信号为绿色。间期细胞单个细胞核中,橘红色信号与绿色信号各显示2个为正常细胞,出现无信号为完全缺失,单信号为部分缺失,3个以上信号点为扩增,与阈值相比较,确定结果的阳阴性。选择杂交信号均匀的区域和信号清晰可辩的细胞进行信号计数。检测值大于阈值(M+3SD),判定为阳性结果；小于阈值,判定为阴性结果；等于阈值,须增加观测样本细胞的数量,如病人p16 FISH检测结果中只有一个信号点的间期细胞比例大于3.9％即阈值(6％),则判断该病人是p16基因缺失的阳性病人；又如病人 p16 FISH检测结果中只有一个信号点的间期细胞比例小于3.9％即阈值(3％),则判断该病人是没有p16缺失的阴性病人。以此类推。　　 4.临床标本检测与应用　　 本研究检测了36例疑似膀胱肿瘤的血尿患者尿液脱落细胞,计数100个细胞,分别使用2组探针进行检测。同时行常规尿脱落细胞学检查,患者留晨尿,收集后常规送细胞学病理检测,连续送检3d；患者行活检病理或术后病理检查,由两名或以上专业的病理科医生共同阅片诊断。　　 5.统计学方法运用与处理　　 采用SPSS13.0统计分析软件,计数资料使用 X2检验,配对计数资料使用McNemar检验进行统计分析,P<0.05,有统计学意义,比较FISH检测技术与常规尿脱落细胞学检测的敏感性和特异性的差别,同时统计分析FISH检测膀胱肿瘤的敏感性和特异性与肿瘤病理分期之间的关系,统计分析3号、7号、9号和17号染色体的畸变与肿瘤的肌层浸润的相关性。　　 结果：　　 1.建立正常阈值　　 正常阈值范围为7号染色体阈值(94.667％～100％)、3号染色体阈值(93.654％～100％)、17号染色体阈值(93.569％～100％)、P16基因阈值(93.813％～100％)；异常阈值为7号染色体阈值(单体5.441％,三体或以上2.041％)、3号染色体阈值(单体6.543％,三体或以上2.862％)、17号染色体阈值(单体6.105％,三体或以上3.212％)、P16基因阈值(单拷贝5.827％,三拷贝或以上2.862％).　　 2..临床标本检测　　 36例活检组织中,术后病理论断膀胱肿瘤30例(术后复发3例)；非肌层浸润性膀胱肿瘤(Tis-T1)13例,肌层浸润性膀胱肿瘤(T2-T4)17例；剩余6例中,未见肿瘤有2例、膀胱炎2例、尿道肉阜1例、肾结核1例。36例疑似膀胱肿瘤血尿患者中,尿脱落细胞检测仅8例阳性,组织病理证实6例为肌层浸润性膀胱肿瘤(高级别,其中1例为术后复发),2例为非浸润性低级别膀胱肿瘤；总敏感度为26.70％,假阴性率为73.33％(22/30),总特异性为100％。其中诊断非肌层浸润性的敏感度为15.38％,肌层浸润性敏感度为35.29％。FISH检测总敏感度为73.33％,总特异度为88.00％,总敏感度高于尿细胞学检测(26.70％),具有统计学意义(P=0.001,X2=13.067)；总特异度略低于尿细胞学检测(100％),差别无统计学意义；具有诊断肌层浸润敏感度(88.24％)高于非肌层浸润性的敏感度(53.85％),二者分别高于尿细胞学检测(尿细胞学检测有肌层浸润的膀胱肿瘤敏感度为35.29％,非肌层浸润膀胱肿瘤敏感度为15.38％),在诊断肌层浸润的膀胱肿瘤两种检测方法有统计学差异(P=0.012).　　 采用3号、7号、9号和17号染色体探针对36例疑似膀胱肿瘤的血尿患者的尿脱落细胞进行检测,结果显示3号、7号、9号和17号染色体的畸变率分别为88.34％、64.71％、70.59％和88.24％,3号和17号染色体的畸变与肿瘤的浸润有相关性,畸变程度与肿瘤浸润深度呈正相关性((Cramer列联系数=0.591,P=0.002；Cramer列联系数=0.523,P=0.007)rp=0.591,P=0.001；rp=0.523,P=0.03)。7和9号染色体的畸变率在肌层浸润性肿瘤和非肌层浸润性肿瘤之间的差别均不具有统计学意义(X2=2.039,P=0.153；X2=3.096,P=0.078)。　　 3.方法学上的改进　　 本研究对FISH检测尿脱落细胞染色体的方法进行了5个方面的改进:(1)取晨起初次尿液,延长尿液在膀胱的停留时间,提高脱落细胞的收集量；(2)同时,采用对细胞吸附力更好的玻璃离心管,提高了实验细胞的总量；(3)由于尿液中的肿瘤细胞比较脆弱,适当减少实验步骤有利于保护目的细胞；(4)同时,由于上皮细胞对胶原酶有耐受作用,所以胶原酶B消化成团细胞的效果并不明显,本实验证明,此步骤是可以完全省略；(5)对于肉眼血尿比较明显的标本,适当提高冰醋酸的比例有助于红细胞的裂解,使背景清晰,同时提高冰醋酸的浓度还有助于染色体的伸展,利于探针的结合,也有助于细胞的膨胀,从而减少染色体的丢失。　　 结论：　　 1.FISH在膀胱肿瘤的早期诊断和病程监测方面较尿细胞学具有更多的优势。操作快速简便且无创,具有较高的灵敏性与特异性,是膀胱肿瘤分子诊断的主要工具。　　 2.FISH在诊断肌层浸润性癌和非肌层浸润性癌中的灵敏度均较尿细胞学检测高,可以弥补尿细胞学诊断膀胱肿瘤灵敏度的不足。　　 3.3号染色体的异常与肿瘤分级有关,可预测肿瘤的浸润性,与肿瘤的恶性程度相关；17号染色体的畸变与肿瘤的分级分期密切相关,有望成为膀胱肿瘤进展和侵袭的标志物。　　 4.留取清晨初次尿液标本,采用玻璃离心管离心,一定程度上解决了尿液标本细胞收集困难的问题；免去胶原酶消化步骤,减少实验步骤有利于对肿瘤细胞的保存,降低假阴性率；对于肉眼血尿明显的标本适当提高冰醋酸含量,不仅降低背景着色,同时有利于染色体的散开,利于探针与目的片段的结合。