Fengycin源于淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciensfmb-50，CGMCCNo.6249)发酵液中，经提取、分离、纯化而得。其结构式由β-羟基脂肪酸(C16～C19)和10个氨基酸组成，其中8个氨基酸组成一个肽环。由于结构的特殊性，它具有两性物质的特点。目前国内外对于fengyein的活性研究，仅停留在抗真菌活性方面。有关fengycin的抗肿瘤活性研究尚未见报道。　　本论文首先研究了fengycin体外对多株人源细胞增殖活力的影响，在明确其具有抑制肿瘤细胞生长作用基础上，以人肺癌95D细胞和人胃癌BGC-823细胞为对象，研究了fengycin体外诱导肿瘤细胞凋亡的作用。然后选用人肺癌95D和人胃癌BGC-823裸小鼠移植瘤模型，研究了fengycin体内抗肿瘤作用。接着对fengycin诱导肿瘤细胞凋亡作用的机制进行了研究。最后，又研究了诱导肿瘤细胞凋亡主要诱因ROS的来源。主要结果如下:　　1.Fengycin体外诱导肿瘤细胞凋亡作用的研究　　用MTT法检测了fengycin对7株人源肿瘤细胞及2株人源正常细胞细胞增殖活力的影响。经fengycin处理后，7株肿瘤细胞的生长被不同程度地抑制。当fengycin(400μg/mL)给药72h，对95D、A-549、H460、BGC-823、SGC-7901、HCT-116、MCF-7的生长抑制率分别为:76％、45％、54％、67％、48％、55％、58％;而同样浓度的fengyein作用正常细胞L02和HELF，其抑制率仅为15％和25％。Fengycin作用95D细胞24h、48h、72h的IC50分别为239.9、177.8、154.9μg/mL;fengycin作用BGC-823细胞24h、48h、72h的IC50分别为281、196、151μg/mL。　　研究了fengyein对肿瘤细胞及正常细胞膜通透性的影响。fengycin(100、200、400μg/ml)给药95D细胞12h，LDH释放率由空白对照组7.1％分别增加到29.5％、31.2％、39.9％;fengycin（100、200、400μg/ml）给药95D细胞24小时，LDH释放率由空白对照组9.1％分别增加到37.5％、38.2％、42.6％;fengycin(100、200、400μg/ml)作用95D细胞48小时，LDH释放率分别增加到40.5％、41.5％、57.6％，空白对照组为8.2％。fengycin（100、200、400μg/mL）作用BGC-823细胞12小时，LDH释放率由对照组的6.1％分别增加到31.5％、32.7％、41％;fengyein（100、200、400μg/mL）作用BGC-823细胞24小时，LDH释放率由对照组的10.18％分别增加到38.67％、39.6％、44.6％;fengycin（100、200、400μg/mL）作用BGC-823细胞48小时，LDH释放率由对照组的9.1％分别增加到41.5％、43.5％、58.6％。对细胞膜通透性研究结果显示，随着fengycin给药浓度增加和给药时间的延长，LDH释放量也逐渐增加，即细胞膜的通透性逐渐增加。而fengycin(100、200、400μg/mL)作用正常细胞L02及HELF12h、24h、48h，LDH释放率变化不大，即细胞膜的通透性基本无改变。　　接着又进一步研究了fengyein对95D及BGC-823肿瘤细胞凋亡的诱导作用。fengycin（100、200、400μg/mL）处理95D细胞24h，DAPI染色后荧光显微镜观察，细胞核内的染色质凝集，固缩，甚至碎裂，并有凋亡小体出现，随着fengycin给药浓度的增加，细胞核中凋亡小体比例逐渐增多。fengycin（100、200、400μg/mL）处理BGC-823细胞24h，琼脂糖凝胶电泳检测，细胞中的DNA碎片明显增多，随着fengycin给药浓度的增加，DNA碎片比例逐渐增多。DNA损伤的结果表明，fengycin诱导95D细胞和BGC-823细胞发生了凋亡，且凋亡作用呈剂量依赖性。　　DNA损伤也进一步阻止了细胞增殖周期的进行。采用PI单染流式分析，fengycin（100、200、400μg/mL）分别给药95D细胞和BGC-823细胞12h和24h，细胞G1期百分比随着fengycin给药浓度的增加和给药时间的延长而升高，同时细胞的S期和G2/M期百分比例下降。Westernblot和RT-PCR检测的周期蛋白CyclinD1和CDK4表达水平也随着fengycin给药浓度的增加和给药时间的延长而降低。结果显示fengycin阻滞两个细胞增殖在G0/G1期。　　细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)外翻是细胞发生凋亡的标志之一。采用AnnexinV/PI双染流式分析，fengycin（100、200、400μg／mL）给药95D细胞24h，细胞部分PS外翻，细胞早期凋亡率由对照组的4.29％分别增加到14.37％、35.78％、47.12％;fengycin(100、200、400μg/mL)作用95D细胞48h时，细胞早期凋亡率由对照组的8.45％上升至19.06％、41.02％、47.78％。fengycin（100、200、400μg/mL）作用BGC-823细胞24h，细胞部分PS外翻，细胞早期凋亡率由对照组的3.64％分别增加到5.5％、26.6％、34.4％;fengycin（100、200、400μg/mL）作用BGC-823细胞48h，细胞早期凋亡率由对照组的2.64％分别增加到21.5％、37.2％、57.2％。结果表明，随着fengycin药物浓度增加及给药时间延长，细胞PS外翻比例增加，细胞凋亡率逐渐上升。　　2.Fengycin对人源细胞裸小鼠移植瘤的生长抑制作用及其初步机制的研究　　在体外细胞研究基础上，以人肺癌细胞95D和人胃癌BGC-823裸小鼠移植瘤模型为研究对象，探讨了fengycin的体内抗肿瘤作用，并对其作用机制进行了初步研究。结果表明，fengycin对人肺癌细胞95D和人胃癌BGC-823裸小鼠移植瘤的生长均有一定程度的抑制作用，与空白对照组相比，fengycin以40mg/kg，20mg/kg，10mg/kg腹腔注射给药，连续给药21天，对人肺癌细胞95D裸小鼠移植瘤的抑瘤率达67.01％、44.04％和29.5％;fengyein以40mg/kg，20mg/kg，10mg/kg腹腔注射给药，连续给药14天，对人胃癌BGC-823裸小鼠移植瘤的抑瘤率达74.01％、48.46％％、30.40％。给予fengycin各剂量组小鼠体重正常增加，脾指数未见明显的变化。提示fengycin对小鼠免疫功能未见明显影响。谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)作为转氨酶中较为关键的酶类，常用来作为肝功能检查的指标。给予fengyein各剂量组小鼠血清中这两种酶的活性没有发生明显的变化，说明fengycin对小鼠肝脏未见明显毒性。在fengycin对人胃癌BGC-823裸鼠移植瘤体内抗肿瘤实验中，对体内抗肿瘤作用的机制进行了初步研究。人胃癌BGC-823裸鼠移植瘤小鼠给予fengycin(40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg)后，瘤组织中可检测到cleaved-Caspase-3，Bcl-2蛋白表达的下降以及Bax/Bcl-2比值的升高，并且肿瘤组织切片中观察到凋亡的细胞，表明fengycin体内可诱导移植瘤细胞的凋亡。　　3.Fengycin诱导肿瘤细胞凋亡作用的机制研究　　诱导肿瘤细胞凋亡可能是fengycin体内抗肿瘤作用机制之一，首先以人肺癌95D细胞为对象，研究fengycin体外诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制。　　研究了Caspase家族蛋白在fengycin诱导的凋亡中的作用，对凋亡通路进行了研究。Caspase测定结果表明fengycin（200μg/ml）给药后凋亡执行蛋白Caspase-3被激活，线粒体凋亡通路的下游蛋白Caspase-9被激活，而外源性通路的Caspase-8无明显变化，说明fengycin体外是通过线粒体凋亡通路诱导95D细胞凋亡。　　在此基础上就fengycin对线粒体凋亡通路的机制加以研究。采用Rhodamine-123荧光染色和Fluo-3荧光探针，激光共聚焦显微镜检测fengycin对95D细胞线粒体膜电位及Ca2+浓度的影响。结果显示，fengycin（200μg/ml）作用95D细胞24小时后，线粒体膜电势位下降，胞浆中Ca2+升高;Westernblot检测Bax蛋白表达上调而Bcl-2蛋白表达量下调，同时伴随着Cyt-C从线粒体释放到胞浆，激活Apaf-1，从而证明fengycin激活线粒体凋亡通路;随着PARP、pro-Caspase-9和pro-Caspase-3表达量下降，进一步验证fengycin通过线粒体凋亡通路诱导了细胞凋亡发生。　　研究了胞浆中ROS水平，fengycin（200μg/ml）作用95D细胞6、12及24小时后，用DCFH-DA检测胞浆中ROS释放量，DCF荧光强度由空白组的27.51％分别增加到60.82％、67.53％及77.17％，结果说明fengycin作用95D细胞后，胞浆中ROS水平升高，且随着给药时间的延长，ROS释放量也进一步增加;在接下来的实验中，加入抗氧化剂NAC，结果显示，NAC显著减弱了fengyein诱导95D细胞凋亡现象的发生，并跟踪检测了线粒体释放的Cyt-C及线粒体凋亡通路的下游蛋白pro-Caspase-9表达水平，进一步验证了fengycin诱导的凋亡作用是ROS依赖性的。　　接着又以BGC-823细胞为研究对象，对其凋亡的通路及线粒体凋亡途径凋亡蛋白进行检测，结果显示，fengycin诱导BGC-823细胞凋亡的作用机制与95D细胞一致。重点阐述了诱导肿瘤细胞凋亡的关键因子ROS来源及ROS在细胞凋亡中的作用。研究结果表明，fengycin可能最先激活BGC-823细胞膜上NADPH氧化酶，导致过量ROS产生。过量的ROS一方面直接激活线粒体凋亡通路，诱导肿瘤细胞凋亡。另一方面活化MAPKs信号通路中p-JNK、p-ERK表达，进一步激活线粒体凋亡通路，抑制Bcl-2蛋白表达，最终诱导细胞凋亡发生。NOX1siRNA研究结果也验证了fengycin主要是激活BGC-823细胞膜上NOX1，产生过量ROS。另外，加入抗氧化剂NAC作用的结果再一次表明，fengycin诱导的凋亡作用是ROS依赖性的，从而证明了ROS在细胞凋亡产生中的重要性。　　综上所述，fengyein具有较强的体内外抗肿瘤作用，而诱导肿瘤细胞凋亡是其发挥抗肿瘤作用的重要机制，fengycin主要是激活肿瘤细胞膜上NADPH氧化酶产生过量的ROS，进而激活线粒体凋亡通路和MAPKs信号通路最终诱导肿瘤细胞发生凋亡而发挥作用。