大肠癌是世界范围内发病及死亡率较高的恶性肿瘤。近年来我国的大肠癌发生率也呈逐年上升趋势。遗传、饮食、肠道内微生态失衡等因素可能与其发生、发展相关。早期治疗的大肠癌一般预后良好，但对于进展期大肠癌患者，大多数治疗效果不尽人意。故探求新的有效治疗手段对挽救进展期大肠癌患者生命和提高生存质量具有重要意义。草酸铂（Oxaliplatin）是新一代铂类抗肿瘤药物，具有抗癌谱广，毒副作用小等优点，尤其可以有效治疗进展期大肠癌。然而由于临床用药的盲目与滥用，无论单独还是联合应用，草酸铂的目标有效率也仅为20％-55％。因此，提高草酸铂使用的有效性及安全性，降低耐药性的相关研究逐渐受到普遍关注。铂类药物的细胞毒作用主要归因为铂原子与细胞内DNA特异位点结合形成的铂-DNA加合物产生链间交联或链内交联，抑制DNA复制转录，导致细胞死亡。故其药物抵抗性与肿瘤细胞DNA损伤修复能力密切相关。草酸铂因具有1，2二氨基环己烷（DACH）结构，与DNA链中的鸟氨酸形成的铂-DNA加合物更易诱导参与核苷酸切除修复（NER）途径的酶类，启动NER。切除修复交叉互补集团1基因（ERCC1）是NER途径中的关键因子，具有结构特异性核酸内切酶活性。ERCC1蛋白表达缺陷会降低细胞的DNA损伤修复能力，致使细胞对草酸铂敏感性升高。据报道ERCC1基因存在着两个常见的单核苷酸多态性（SNPs），其中一个是位于第4外显子118密码子（ERCC1 codon 118）单核苷酸多态性（rs11615）。尽管这是一种保守的同义核苷酸突变（AAC→AAT），两者皆编码丝氨酸（Asn），但有人已将该SNP作为判断草酸铂治疗进展期肠癌疗效的一个遗传预测标记，认为该SNP不同基因型可能通过改变ERCC1蛋白表达水平而导致肿瘤细胞对于草酸铂敏感性的差异。本研究首先比较ERCC1在术中取材的大肠肿瘤组织及标准化肠癌细胞系中表达水平与草酸铂敏感性的关联，并以中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）野生型AA8和ERCC1表达缺失型UV20作为细胞对照模型，根据所建立的评价草酸铂细胞毒性及DNA损伤修复的实验方法，系统研究了草酸铂细胞毒性机制。另外，利用Gateway定向克隆技术构建两种包含ERCC1 codon 118 SNP不同基因型的表达载体，分别转染ERCC1表达缺失型CHO细胞UV20，获得稳定转染细胞系后，比较ERCC1 codon 118 SNP不同基因型对ERCC1蛋白表达水平、细胞DNA损伤修复能力及对草酸铂敏感性的影响。本研究旨在探寻草酸铂治疗进展期大肠癌的分子标志物，以达到选择合理优化药物治疗方案，提高草酸铂使用的安全性及有效性的目的。另外，本研究有别于以往相关研究单纯注重临床病例资料生存分析的方法，多角度地系统阐明草酸铂的细胞毒作用机制。Gateway定向克隆技术构建包含不同ERCC1 SNP表达载体，获得稳定转染细胞系，提供体外研究DNA损伤修复基因遗传多态性的一个实验技术平台，打开了一种解决棘手的抗肿瘤药物耐药性问题的全新思路，无疑对相关领域研究具有重要的理论意义和实际价值。方法一、材料1、大肠癌组织标本来源与处理术中取直径约为2cm以上的新鲜大肠癌组织，切开为两部分。一部分立刻进行原代细胞培养；另外一部分保存于液氮中，保存备用。同时记录患者性别、年龄、临床分期、病理类型等一般自然情况。2、肿瘤组织原代细胞培养术中切除的肿瘤组织，碘氟消毒后，用含适量双抗液的生理盐水常规制成单细胞悬液。含10％小牛血清的RPMI-1640液调整细胞浓度后，种植于无菌96孔细胞培养板上。CO₂细胞培养箱孵育24h后，无污染，细胞贴壁者为培养成功细胞。3、细胞系及细胞培养五种肠癌细胞系：LOVO、COL0320、HCT81、DLD-1、SW48和中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）：AA8、UV20。含青霉素钾10万单位／L，硫酸链霉素0.1g／L，5％胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5％CO₂培养箱中培养，备用。4、Gateway定向克隆技术构建的ERCC1表达载体整个过程大致分为以下两步：一是创建Gateway入门克隆：根据λ嗜菌体位点B P特异重组获得包含ERCC1目的基因的载体pDONR201-ERCC1（C／C或T／T），PstⅠ酶切鉴定，PSQ分析仪鉴别ERCC1基因型。二是将包含ERCC1目的基因的入门克隆pDONR201-ERCC1，pIRES-GFP300ng共同孵育，通过LR结合反应产生表达克隆pIRES-GFP-ERCC1（C／C或T／T）。HindⅢ、BglⅡ酶切鉴定并测序。5、建立稳定表达不同ERCC1 SNP的转染细胞系pIRES-GFP-ERCC1（C／C或T／T）质粒转染UV20细胞，同时pIRES-GFP空质粒做为对照。转染细胞可在含5％G418培养液中生长并表达绿色荧光蛋白，获三种稳定转染细胞：UV20-ERCC1（C／C）、UV20-ERCC1（T／T）、UV20-GFP。测序鉴定。二、实验方法1、肿瘤组织、各细胞系总RNA提取及逆转录合成cDNATRIZOL试剂或β-Mercaptoethanol溶解细胞，异丙醇法提取总RNA。cDNA合成总反应体系20μl中RNA含量为1μg，总反应体系中包括5×逆转录缓冲液、四种dNTP混合液、随机引物、RNase Inhibator、AMV反转录酶。2、肿瘤组织及各细胞系ERCC1 mRNA水平测定逆转录PCR（RT-PCR）扩增肿瘤组织cDNA的ERCC1目的片段（894bp）。琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，紫外灯下拍照，与β-actin对比后，根据灰度值比较大肠癌组织ERCC1mRNA表达情况。7500 Taqman Real-Time PCR反应仪检测各肠癌细胞系、CHO细胞的ERCC1mRNA水平（探针法）和内参考基因GAPDH mRNA水平（SYBR green法）。计算Log10 ERCC1ΔCT。3、CHO细胞、转染细胞蛋白提取及Westernblot检测ERCC1蛋白表达冻融法提取蛋白。离心后收获蛋白上清。Coomassie蛋白定量法测定蛋白浓度。聚丙稀凝胶电泳法—Westernblot检测ERCC1蛋白表达。一抗：山羊抗人ERCC1稀释浓度1：1000；4℃孵育过夜。二抗：HRP标记驴抗山羊IgG稀释浓度1：10000。常规进行转膜、杂交、ECL反应、曝光及洗片。同时设立仅有二抗的阴性对照，以证明实验结果的特异性。4、DNA短序列分析鉴定ERCC1 SNP基因型PCR扩增包含ERCC1 codon 118 SNP一段80bp基因片段，根据实验要求及操作指南上样于PSQ分析仪，测定ERCC1 codon118 SNP基因型。SQA 96 MA软件分析源于不同cDNA的ERCC1 SNP基因型。5、草酸铂的细胞抑制率测定根据实验要求将不同种类细胞接种于96孔细胞培养板16-24h细胞贴壁后，0～2×10⁵nM浓度范围草酸铂染毒24h，更换培养液，另培养72h。MTT法测定草酸铂对大肠癌组织原代培养细胞抑制率，并计算IC₅₀。SRB法测定草酸铂对肠癌细胞系、CHO细胞抑制率，并计算IC₅₀。6、改良彗星实验检测草酸铂所致DNA损伤根据实验要求将不同种类细胞接种6孔培养板16-24h细胞贴壁后，195、3125nM草酸铂染毒1h，弃培养液，继续培养6h，24h。30μM H₂O₂诱导单链DNA断裂后收获细胞。经制片、裂解、解旋、电泳、中和、EB染色，荧光显微镜下拍照评分。7、Rad51免疫荧光实验评价细胞的DNA损伤修复能力根据实验要求将不同种类细胞接种24孔培养板。195、3125nM草酸铂染毒1h后，弃培养液，继续培养6h，24h。多聚甲醛固定。Rad51一抗：Rabbit anti-Rad51，稀释1／1000，孵育90 minRad51二抗：Alexa-488-conjugateGoat anti Rabbit IgG，稀释1／5000，孵育60minDAPI核染色。荧光显微镜下拍照，计数FOCI数目，划分等级并评分。三、数据分析采用EXCEL数据库录用数据。SPSS11.5统计软件进行统计分析。数据统计描述主要以（?）±s形式表示。根据数据的正态性，选择Pearson相关分析、Spearman等级相关、单因素方差分析或Kruskal-WaUis检验，LSD或秩和检验进行多重比较。检验水准α=0.05。结果1、逆转录PCR测定大肠肿瘤组织中的ERCC1mRNA水平与肿瘤原代培养细胞的草酸铂IC₅₀呈正相关关系。（Spearman等级相关分析，相关系数r_s=0.711，P=0.032）。实时-定量PCR分析肠癌细胞系中的ERCC1mRNA水平，与相应草酸铂IC₅₀呈正相关关系。Pearson相关分析表明，无论草酸铂处理前后，IC₅₀与ERCC1mRNA水平呈正相关（处理前：r=0.910，P=0.032；处理后：r=0.907，P=0.037），可见，无论对于大肠癌组织还是肠癌细胞系，随着ERCC1表达水平的升高，肿瘤细胞对草酸铂的敏感性降低。2、实时-定量PCR测定195nM草酸铂处理前后各肠癌细胞ERCC1mRNA水平，结果显示各肠癌细胞草酸铂处理前后ERCClmRNA水平并无明显改变。3、彗星实验反应ERCC1对草酸铂所致DNA损伤及损伤修复能力的影响。AA8抑或UV20均随着草酸铂浓度增加，DNA损伤程度趋于严重。相对于AA8而言，无论195还是3125nM，UV20都表现出较重的DNA损伤。AA8在草酸铂处理后6h产生的DNA损伤，在24h时由于完善的DNA修复系统而得到部分修复。而ERCC1表达缺失的UV20，却无明显的损伤修复能力。4、AA8、UV20在不同浓度草酸铂处理后6h、24h时点上，分别进行Rad51免疫荧光实验。UV20在3125nM草酸铂处理后24h，DNA损伤断裂比AA8更加明显。5、包含ERCC1入门载体pDONR-ERCC1（3150bp）转化大肠杆菌（E.coli DH5α），可选择生长于含1％卡那霉素培养基平板，质粒纯化后，用PstⅠ进行限制性酶切，得到533 bp和2617 bp的预期片段。包含ERCC1表达载体pIRES-GFP-ERCC1（6626 bp）转化E．coli DH5α可选择生长于1％氨苄青霉素，经HindⅢ酶切后可获1227bp，5039bp片段，经BgⅡ酶切后可获891bp，5735bp片段。对构建的表达载体进行测序，ERCC1序列正确无误。6、pIRES-GFP-ERCC1（C／C）及pIRES-GFP-ERCC1（T／T）质粒转染UV20细胞，同时转染pIRES-GFP质粒做为空对照质粒。转染细胞可在含10％G418的DMEM培养基选择生长，次日调G418浓度为5％，五日后，荧光显微镜下可见表达绿色荧光蛋白的转染细胞，转染效率达85％以上。7、Westernblot鉴定ERCC1基因在各细胞中的表达，分别于UV20-ERCC1（C／C）或UV20-ERCC1（T／T）细胞可表达分子量为38kDa的ERCC1蛋白，进一步证实细胞转染成功。8、PSQ⁹⁶MA分析仪验证不同细胞的ERCCl SNPs：两种转染细胞UV20-ERCC1（C／C）或UV20-ERCC1（T／T）ERCC1 SNP基因型不同，分别为C或T。9、两种ERCC1 SNPs转染细胞ERCC1mRNA水平高于AA8，但两者彼此之间差别并无统计学意义（单因素方差分析F=664.06，P=0.00；LSD，P=0.648）。10、SRB细胞抑制率测定和细胞克隆实验结果说明草酸铂对各细胞的毒性效应。ERCC1缺失型细胞（UV20，UV20-GFP）对草酸铂表现出较强的敏感性，与AA8相比，IC₅₀降低约16倍。而ERCC1过表达转染细胞则表现对草酸铂高耐药性，IC₅₀值与UV₂₀相比，升高了32倍。对于两种不同ERCC1 SNPs转染细胞，细胞抑制率同样无明显差别。细胞克隆实验结果如下：3125nM草酸铂浓度时，AA8，ERCC1过表达转染细胞的存活率达50％以上。781nM时，上述细胞存活率达80％以上，但仍无ERCC1表达缺失细胞的存活。直至195nM时，UV20和UV20-GFP可存活45％左右。同样，对于两种ERCC1不同SNPs转染细胞，草酸铂高低剂量组细胞抑制率均无明显差别（LSD，P＞0.05）。11、草酸铂染毒后24h改良彗星实验显示，ERCC1过表达可以使DNA损伤修复能力增强，但不同SNPs似乎对这种能力的影响没有差别。Rad51免疫荧光实验结果也同样验证了上述结果：两种ERCC1转染细胞在草酸铂染毒24h形成DNA断裂FOCI的数量并无显著性差异。结论1、草酸铂药物抗性与大肠癌组织或肠癌细胞系中固有的ERCC1蛋白表达水平呈正向相关关系，核苷酸切除交叉互补集团1基因（ERCC1）mRNA水平可以作为草酸铂治疗肠癌预后预测的一个遗传标记。2、草酸铂以一种DNA内交联剂形式，与DNA双链相互作用形成DACH-Pt-DNA加合物，阻止DNA复制，导致细胞损伤。细胞本身的DNA损伤修复能力与草酸铂敏感性密切相关，而ERCC1蛋白在草酸铂所致的DNA损伤修复中起到关键的切除修复作用。3、Gateway定向克隆技术成功构建包含不同ERCC1 codon 118 SNPs基因型的表达载体，并获得稳定转染细胞系，提供了体外研究ERCC1基因多态性的实验技术平台。4、本研究未发现ERCC1 codon 118 SNP不同基因型在ERCC1蛋白表达、DNA修复能力及对草酸铂敏感性方面的显著差异。ERCC1 codon 118 SNP作为预测草酸铂治疗方案效果的遗传学标志尚须进一步探讨。