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背景：骨质疏松是一种在绝经期妇女和老龄化人群中发病率很高的临床疾病,发病的根本原因在于骨形成和骨重吸收间的平衡被打破,会导致病理性骨折等其他一系列严重的并发症。研究表明,年龄相关的骨质疏松通常伴随着骨髓内脂肪细胞的增多和骨丢失,而且在发生骨质疏松的骨里,减少的骨形成与增加的脂肪组织有直接的关联性。成骨细胞(OB, osteoblast)与骨髓的脂肪细胞(AD, adipocyte)都由共同的前体细胞分化而来,即骨髓间充质干细胞(BMSCs, bone marrow mesenchymal stem cells)体外实验已经显示,与健康的女性相比,来自于绝经期妇女体内的骨髓间充质干细胞经过培养,更容易分化为脂肪细胞而非成骨细胞。成骨细胞与脂肪细胞都有很强的分化可塑性,由人体间充质干细胞完全分化成熟的成骨细胞表现出了分化转化为脂肪细胞的能力,反之亦然。还有报道发现,间充质干细胞分化为脂肪细胞或者成骨细胞,完全是一种骨髓内的平衡状态。Beresford JN等的研究表明了脂肪细胞系分化与成骨细胞系分化之间此消彼长的关系。此外,Aline Clabaut等采用体外共培养系统进行研究发现,间充质干细胞来源的脂肪细胞能够诱导间充质干细胞来源的成骨细胞分化出脂肪细胞的表型。另一方面,大量的实验研究指出,脂肪细胞能够分泌许多细胞因子,如荷尔蒙、瘦素、脂联素、脂肪酸等,这些细胞因子直接影响着周围细胞的增殖、凋亡和功能。Alexandre Elbaza的研究证明,骨髓中的脂肪细胞对成骨细胞存在脂毒性作用。除此之外,最近实验结果指出,在PGE2(prostaglandinE2,前列腺素E2)缺乏的情况下,与成骨细胞前提细胞相比,脂肪细胞前体细胞具有更强的促使破骨细胞(OC, osteoclast)样细胞形成的作用,这表明在骨髓细胞成脂分化和破骨分化间存在一种新兴的关联。现有的证据已经表明,骨髓内脂肪的积累可能在骨质疏松的起病中扮演着非常重要的作用,而此作用主要归因于其潜在的对骨髓基质干细胞分化和(或)破骨细胞调控的骨重吸收稳态的影响。鉴于此观点,逆转骨髓内脂肪形成或许是防治年龄相关性骨质疏松的有效治疗方案。N-3长链多不饱和脂肪酸(PUFAs, polyunsaturated fatty acids)是人体的必须脂肪酸,人体自身无法合成,如亚麻酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。在过去的几十年中,无论是体外还是体内试验,都证明了n-3PUFAs对于抵抗骨丢失的积极作用。但是n-3PUFAs保护骨组织健康的潜在作用机制却并没有得到完全的阐明。部分研究称,n-3PUFAs抑制破骨细胞分化与活化的作用可能是其抵抗骨质疏松的机制之一。目的：据我们所了解,至今还没有关于n-3PUFAs对骨髓内脂肪形成的作用与机制的科学研究。本实验选用一种过度表达fat-1基因的转基因小鼠作为动物模型,此种小鼠体内的fat-1基因来自线虫体内,能够将n-6PUFAs内源性转化为n-3PUFAs。本文通过转基因动物模型,探讨在骨质疏松状态下内源性n-3PUFAs对骨髓内脂肪形成的影响,旨在为当前临床防治骨质疏松症提供新的视角。方法：本研究旨在通过转基因动物模型在体内水平探讨内源性n-3PUFAs对骨髓内脂肪形成的影响及其分子机制。采用PCR技术分别鉴定出fat-1基因阳性表达(fat-1组)和阴性表达的C57BL6小鼠(野生型组),建立去卵巢骨质疏松小鼠模型。术后3个月,运用micro-CT检测内源性n-3PUFAs对去卵巢诱导骨质疏松的fat-1小鼠骨组织形态微结构的影响,并采用组织形态分析技术、免疫组织化学技术、免疫荧光技术检测内源性n-3PUFAs对去势fat-1小鼠骨髓内脂肪形成的影响。结果：1、内源性n-3PUFAs对去卵巢骨质疏松诱导小鼠模型体重、腹部脂肪的影响去卵巢组小鼠的卵巢重量与假手术组相比具有统计学差异,确定去卵巢诱导骨质疏松模型成功建立。与去卵巢野生型组相比,术后3个月,去卵巢fat-1小鼠的体重与腹部脂肪组织重量均有统计学差异(P<0.05),但是体重与腹部脂肪组织重量在假手术的fat-1和野生型小鼠之间没有统计学差异(P>0.05)。去卵巢小鼠的体重比假手术对照组小鼠的体重更高(P<0.05)2、内源性n-3PUFAs对骨微结构的影响Micro-CT (micro computed tomography)扫描结果显示：与假手术组相比,去卵巢小鼠股骨扫描区域的BMD(骨密度)、BMC(骨矿物含量)、BV/TV(骨体积／总体积)和Tb.N(骨小梁数)较低,且有显著性差异(P<0.05)。去卵巢fat-1小鼠股骨远端的BMD, BV/TV和BMC的值都比去卵巢野生型小鼠高(P<0.05),但是,与去卵fat-1小鼠相比,去卵巢野生型小鼠股骨远端的TB.N的值仅轻微减低(P>0.05)。此四项骨微结构参数在fat-1假手术组和野生型假手术组之间没有统计学差异。3、内源性n-3PUFAs对骨髓脂肪的影响组织形态学分析结果显示：在野生型或fat-1小鼠组里,与假手术组相比,去卵巢小鼠骨髓内脂肪细胞的数量均显著增多(P<0.05)。脂肪细胞参数：AV/TV(脂肪体积／总体积)与AD#的组织学分析结果同样显示,相对于去卵巢fat-1小鼠,去卵巢野生型小鼠骨髓内出现更多的脂肪聚集,切具有显著性差异(P<0.05)。4、内源性PUFAs对骨髓内转录因子PPARy与RUNX2表达的影响PPARy是成脂过程中的关键转录因子,其表达与活性的水平高低决定了骨髓间充质干细胞向成骨细胞系还是脂肪细胞系分化。免疫荧光结果显示：卵巢切除会显著提高小鼠骨髓内PPARy的表达(P<0.05),而且与野生型去卵巢小鼠相比,fat-1去卵巢小鼠骨髓内PPARy表达显著降低(P<0.05)。野生型与fat-1假手术组小鼠间PPARy的表达并无明显差别。RUNX2作为成骨细胞分化过程中的关键调控因子,在骨形成中发挥着重要的作用。免疫组化结果显示：相对于去卵巢组小鼠,假手术组小鼠骨髓内RUNX2的阳性免疫表达显著增强(P<0.05)。在野生型去卵巢组,RUNX2的阳性表达比fat-1去卵巢组显著降低(P<0.05)。RUNX2蛋白表达在野生型和fat-1假手术组间并无显著性差异。结论：本课题研究证明,内源性n-3PUFAs能够抵抗去卵巢诱导的骨质疏松,一定程度上是通过抑制骨髓内脂肪的形成来达到此作用。内源性n-3PUFAs促使间充质干细胞向更多的成骨细胞以及更少的脂肪细胞分化,进而保护骨的丢失。