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背景血管发生是肿瘤的生长、侵袭和转移所必须的。对肿瘤血管生成的抑制被认为是一种重要的抗肿瘤治疗方法。现在已经发现的众多血管生成抑制剂中,有的已经投入临床使用。它们的抗肿瘤作用机制表现在抑制内皮细胞的增殖和移行或诱导血管内皮细胞凋亡。Filamin A interacting protein 1-like (FILIP1L)是在检测内皮细胞在对血管生成抑制剂的反应时基因表达的情况时,所鉴定出来的一个上调表达的基因。研究表明过表达的FILIP1L导致了内皮细胞增殖和迁移的抑制,并且细胞的凋亡也增加。对FILIP1L的研究提示我们:它可能是血管生成抑制剂作用的调节因子;并且是潜在的抗肿瘤血管生成的靶标。本研究首先从食管鳞癌细胞系EC9706中克隆FILIP1L胞外段编码基因,经测序验证后,构建pET22b- FILIP1L原核表达载体并转入大肠杆菌表达感受态,采用亲和纯化技术纯化重组融合蛋白,并制备以FILIP1L蛋白为抗原的多克隆抗体,进一步探讨FILIP1L相互作用蛋白的表达情况。目的通过构建pET22b- FILIP1L原核表达载体并诱导蛋白表达纯化后,用所得蛋白制备多克隆抗体,研究在肿瘤细胞和正常细胞中与FILIP1L蛋白结合的相互作用蛋白组分差异,阐明FILIP1L在抗肿瘤血管生成中发挥抑制肿瘤血管生成作用的分子机制,为进一步明晰恶性肿瘤多分子、多阶段演进分子机制及癌症治疗新靶点奠定重要基础。方法从食管上皮鳞癌细胞EC9706中提取mRNA并反转录成cDNA,利用RT-PCR技术扩增含有全长FILIP1L基因(963bp左右)的cDNA,将其定向插入原核表达载体pET22b,经测序确定载体构建成功后,诱导重组质粒蛋白表达;Western blotting检测表达蛋白成功,并利用亲和层析技术纯化得到诱导蛋白;用诱导蛋白免疫动物制备多克隆抗体,进一步运用免疫共沉淀技术检测FILIP1L的相互作用蛋白表达差异。结果1.从食管上皮鳞癌细胞EC9706中得到了FILIP1L胞外段基因,验证序列准确无误;2.构建了FILIP1L原核表达载体并诱导诱导蛋白表达,纯化得到高纯度蛋白。3.运用纯化得到的蛋白制备得到效价为1:1×106的高效价多克隆抗体。4.利用免疫共沉淀技术筛选正常食管上皮细胞NEC与食管上皮鳞癌细胞EC9706中的与FILIP1L相关蛋白的表达差异情况。结论本研究从食管上皮鳞癌细胞9706中得到了FILIP1L胞外段基因,构建了FILIP1L原核表达载体,利用FILIP1L重组质粒表达融合蛋白,并制备多克隆抗体,检测正常组织与肿瘤组织中相互作用蛋白的差异表达,发现6个与FILIP1L相关的蛋白条带在食管癌细胞与正常食管上皮细胞中的表达有差异,对这些蛋白条带的进一步鉴定,将为今后进一步阐明FILIP1L蛋白在肿瘤发生发展过程中抑制肿瘤血管生成作用的分子机制奠定重要的工作基础,并为探索癌症治疗新靶点开辟新途径。