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背景与目的侵袭转移是恶性肿瘤的基本特征,也是肿瘤患者死亡的主要原因之一。淋巴道是大部分肿瘤最常见的转移途径,有无淋巴结转移也是判断患者预后的重要指标。近年来随着淋巴管标记物以及淋巴管生成因子的发现,文章报道肿瘤细胞可通过自分泌或旁分泌内皮细胞生长因子C/D(VEGF-C/D),诱导肿瘤淋巴管生成,增加肿瘤淋巴道转移的几率。结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一,淋巴道转移是其最常见的转移方式。因此了解结肠癌淋巴管生成情况及其影响干预因素,对加深其淋巴道转移机制的理解和今后的治疗都有相当重要的意义。高迁移率蛋白B1(HMGB1)最早发现可作为一种小分子量DNA结合蛋白在转录调节中发挥重要作用。近年来发现它不仅可作为转录调节因子,还可以在细胞外发挥作用。通过与其受体晚期糖基化终产物受体(RAGE)结合,在炎症,细胞迁移、分化,肿瘤发生、发展等过程中发挥重要作用。在体内,HMGB1主要来自损伤或坏死细胞,或被缺氧、内毒素、TNF-α、IL-1β等因素活化的巨噬细胞。通过活化的巨噬细胞分泌的HMGB1可再度激活巨噬细胞,使其分泌VEGF、TNF-α、IL-8等多种细胞因子。而据报道VEGF-C/D的表达与多种炎症因子有关。已有研究报道HMGB1在肿瘤血管生成方面有一定的影响,而在淋巴管生成方面则未见相关研究。因此,我们拟通过检测HMGB1对结肠癌组织淋巴管生成因子VEGF-C/D表达的影响及其机制的研究,了解其是否对结肠癌的淋巴管生成,淋巴结转移产生影响,从而对结肠癌发生淋巴道转移的机制进行初步探讨。研究方法首先,通过免疫组化的方法,检测结肠癌组织中HMGB1、VEGF-C/D的表达情况,同时利用统计学方法,分析HMGB1表达同VEGF-C/D表达、淋巴管计数、淋巴结转移情况以及其他一些临床病理特征的相关性。其次,体外培养结肠癌细胞、单核巨噬细胞,并以HMGB1作为刺激因子,通过RT-PCR、western blot等方法,检测其对两种细胞VEGF-C/D表达的影响。并针对在胞外,HMGB1主要通过其受体RAGE来激活多种细胞通路的情况,构建NF-κB干扰载体,通过比较HMGB1对干扰组细胞和对照组细胞的VEGF-C/D表达的影响,分析判断HMGB1对VEGF-C/D表达影响的通路。最后,构建HMGB1表达载体,并转染结肠癌细胞HCT116,筛选HMGB1高表达细胞。采用背部皮下种植的的方法造成裸鼠荷瘤模型。比较转染组与对照组种植瘤在淋巴管生成、淋巴结转移方面的差异。结果在结肠癌组织切片免疫组化检测中,可观察到HMGB1表达于癌细胞和巨噬细胞。在70例标本中,阳性率72.9%;有淋巴结转移的患者与无转移的患者之间,HMGB1的阳性率差异显著(P<0.05)。VEGF-C/D也表达于癌细胞及巨噬细胞的细胞质。在肿瘤周围正常组织中则基本没有表达。二者中以VEGF-C表达多见。淋巴结转移患者的VEGF-C阳性率高于无淋巴结转移的患者的阳性率,差异有统计意义。结肠癌组织中HMGB1和VEGF-C/D的表达在病人的年龄、性别、分化程度等方面差异不显著(P>0.05)。通过免疫组化双染观察到结肠癌相关巨噬细胞可同时表达HMGB1、VEGF-C/D,而且经统计分析,发现HMGB1、VEGF-C/D的表达及巨噬细胞计数三者之间存在相关性(P<0.05)。结肠癌组织中淋巴管计数也与HMGB1、VEGF-C有关。在体外实验中,通过不同浓度与时间的HMGB1刺激,经检测mRNA与蛋白表达的改变。发现VEGF-C的表达与HMGB1呈量效关系。在作用时间上,VEGF-C表达增强在HMGB1刺激后12小时达高峰,而VEGF-D则在4小时就达峰值。在转染NF-κB干扰载体后,发现可抑制HMGB1对VEGF-C/D的诱导作用。由此可推测HMGB1与受体结合后可通过活化NF-κB途径来诱导VEGF-C/D的表达。在动物体内实验中,成功构建了HMGB1表达载体并顺利转染HCT116细胞。转染HMGB1的HCT116细胞裸鼠移植瘤与对照组移植瘤相比较,生长相同天数后,转染组淋巴管计数多于未转染组,并有统计学意义。结论本文通过研究结肠癌组织中HMGB1对VEGF-C/D表达的影响及其机制。认为(1)结肠癌组织中HMGB1及VEGF-C/D表达于多种细胞(结肠癌细胞、肿瘤相关巨噬细胞),并且和肿瘤淋巴管生成、淋巴结转移存在相关性。(2)HMGB1可诱导VEGF-C/D在结肠癌细胞和单核巨噬细胞中的表达。(3)HMGB1在与受体结合后可通过NF-κB影响到VEGF-C/D的表达。(4)HMGB1可通过影响肿瘤局部微环境中VEGF-C/D的表达,进而影响到肿瘤淋巴管的生成,对肿瘤的淋巴道转移具有一定作用。