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纳米技术的研究热潮遍布世界各国,纳米银的应用前景也不断被挖掘。纳米银拥有独特的抗菌作用,使其大量应用于日常用品领域、工业领域和生物医学领域。然而研究表明,纳米银能穿透细胞膜进入细胞中,甚至进入细胞核中,可能会引起细胞核内物质形态结构和功能的改变,诱导染色体畸变、DNA损伤和基因突变。广泛的应用使纳米银在各个方面接触人体,并可能与体内不同组织、细胞或生物分子产生相互作用。体内研究表明,纳米银能达到动物骨髓细胞和脏器中,并且停止暴露后能滞留在动物脏器中。评估纳米银对生物的毒性效应至关重要,尤其是与致癌、致畸、致突变相关的遗传毒性效应。本研究首先制备出三种不同粒径的PVP包被纳米银。然后选择所制备纳米银中分散性良好且粒径分布集中的纳米银与市场上购买的两种纳米银一起进行遗传毒性定量评价。根据OECD用于检测遗传毒性致癌物的体内外遗传毒性试验的推荐,再结合纳米银本身特殊性质选择合适试验方法,采取体外彗星实验和胞质阻滞微核组学试验与体内小鼠骨髓微核试验形成组合试验方案,全面考察不同特性纳米银的遗传毒性。对于纳米银体外遗传毒性研究,本研究选取人肝癌细胞(HepG2)作为体外评价模型,分别利用Hoechst-33258染色、彗星实验、胞质阻滞微核组学试验定量研究了三种不同特性纳米银(20nmAgNPs,20nmPVP-AgNPs,40nmPVP-AgNPs)染毒的 HepG2 细胞核形态与凋亡率、DNA损伤、染色体畸变等情况。接着使用20nmPVP-AgNPs染毒人肝癌细胞(HepG2)和人肺癌细胞(A549)24h和48h后进行微核实验,比较纳米银对不同细胞遗传毒性效应的差异。用20nmmPVP-AgNPs染毒HepG2细胞24h比较胞质阻滞微核微核组学试验和微核实验结果差异。对于纳米银体内遗传毒性研究,开展了两种不同包被纳米银(20nmAgNPs,20nmPVP-AgNPs)对小鼠经口给药28天后骨髓微核试验,并考察了小鼠体重变化和骨髓微核率等指标的改变。最后选取人肝癌(HepG2)细胞作为评价模型,运用彗星实验与胞质阻滞微核组学试验,研究了市场中某品牌含银医用生物胶体分散剂的遗传毒性效应。得出的主要结果如下:(1)不同特性纳米银制备及表征结果。使用马尔文粒度仪测得制备所得平均水合粒径94.84nm、111.1nm、120.7nm的PVP包被纳米银。使用TEM观察自行制备的纳米银颗粒和两种市场购买的纳米银颗粒,三种纳米银颗粒平均粒径分别为39.50±9.09 nm、19.95±4.75 nm 和 18.29±5.50 nm。(2)体外遗传毒性研究结果。在相同染毒条件下,三种不同特性纳米银在各个浓度凋亡率均是:20nmPVP-AgNPs>20nmAgNPs>40nmPVP-AgNPs。在所有处理组实验剂量下凋亡率均在10.33%以下。研究发现三种纳米银均可以引起HepG2细胞DNA损伤增加,但是不同特性纳米银对细胞DNA损伤影响具有差异。和对照组比较,染毒24 h后20nmAgNPs组和40nmPVP-AgNPs组中浓度在20μg/mL的Olive尾矩与尾长改变无统计学意义,20nmPVP-AgNPs组20μg/mL的DNA百分比改变无统计学意义,而其余各剂量组各指标都反应HepG2细胞DNA损伤程度都增加。三种纳米银使 HepG2 细胞 DNA 损伤程度:20nmAgNPs>20nmPVP-AgNPs>40nmPVP-AgNPs。胞质阻滞微核组学试验研究表明,除核质桥外,三种材料的各效应指标均有随染毒剂量增高而增高的趋势。说明本实验采用的三种不同特性纳米银材料均对HepG2细胞染色体丢失、染色体断裂、基因扩增与基因量的改变效应呈浓度相关性。三种材料在相同染毒浓度时,总微核数、Ⅰ型微核数、Ⅱ型微核数、核芽数均是20nmPVP-AgNPs>20nmAgNPs>40nmPVP-AgNPs。说明在相同包被下,小粒径纳米银更容易诱发HepG2细胞染色体畸变等相关效应;在相同粒径下,PVP包被纳米银比未包被纳米银更容易诱发HepG2细胞染色体畸变等相关效应。两种不同方法对比研究结果。微核试验研究表明不同浓度20nmPVP-AgNPs染毒A549细胞和HepG2细胞24h、48h后,两株细胞的两种染毒时间内均呈浓度-效应关系。在剂量小于等于80 μg/mL时,两株细胞各浓度微核数均是染毒后24h大于染毒48h,而在剂量为160μg/mL时,两株细胞在染毒48h后的微核数大于24h。在染毒24h时,40～160μg/mL的A549细胞和20～160μg/mL剂量范围内的HepG2细胞微核数变化均出现显著性差异,说明在纳米银染毒24h时HepG2细胞微核数变化敏感度高于A549细胞。比较用胞质阻滞微核微核组学试验和微核实验分别检测20nmPVP-AgNPs染毒HepG2细胞24h在20～160μg/mL剂量范围内都呈现阳性结果。结果表明胞质阻滞微核组学试验表现出比微核试验检测出更多的微核率。提示纳米银的遗传毒性没有受细胞松弛素B影响而减弱遗传毒性效应。说明相比于传统的微核实验,胞质阻滞微核组学试验是一种可以用作测定纳米银遗传毒性的全面而灵敏的实验;HepG2细胞株适宜作为胞质阻滞微核组学试验体外评估纳米银的模型。(3)体内遗传毒性研究结果。不同包被纳米银小鼠骨髓微核试验研究表明,20nmAgNPs组在本试验设计剂量50 mg/kg内在灌胃28天内对小鼠体质量无明显影响。20nmPVP-AgNPs组剂量10 mg/kg内在灌胃28天内对小鼠体质量无明显影响。不同包被纳米银引起小鼠骨髓微核率改变结果表明,20nm无包被纳米银在50mg/kg剂量内和灌胃28天内对小鼠骨髓微核率无明显影响。20nmPVP-AgNPs剂量10mg/kg内在灌胃28d内对小鼠骨髓微核率无明显影响。本实验发现在高剂量250mg/kg下,纳米银能导致小鼠体内细胞产生染色体畸变效应。20nmPVP-AgNPs对小鼠体重和骨髓微核率影响均大于20nm无包被纳米银。(4)选取人肝癌(HepG2)细胞作为评价模型,运用彗星实验与胞质阻滞微核组学试验,研究了市场中某品牌含银医用生物胶体分散剂的遗传毒性效应结果。超微量微孔板分光光度计检测某品牌含银医用生物胶体分散剂结果显示未出现纳米银颗粒特征吸收峰,而马尔文粒径分析仪检测结果显示有颗粒特征吸收峰的出现,考虑到是由该分散剂中有胶体颗粒团聚或者存在的极微量纳米银颗粒存在造成的。由此得出“某品牌含银医用生物胶体分散剂”中银的成分可能主要为银离子胶团。彗星实验和胞质阻滞微核组学试验测定分散剂对HepG2细胞遗传毒性结果表明,Olive尾矩、尾长、尾部DNA百分比和Ⅱ型微核数均在0.125μg/mL和0.25μg/mL时与空白对照组有差异。说明在0.125μg/mL和0.25μg/mL剂量下某品牌含银医用生物胶体分散剂可能引起HepG2细胞DNA和染色体丢失。综上所述,本研究探讨了不同特性纳米银体内外遗传毒性差异,包括DNA损伤、染色体丢失、染色体断裂、基因扩增与基因量的改变等效应。结果表明相同粒径下,无包被纳米银比PVP包被纳米银更容易引起DNA损伤,PVP包被纳米银比无包被纳米银更容易引起细胞和动物染色体畸变相关效应。体外遗传毒性实验彗星实验和胞质阻滞微核组学试验表明,在相同包被下,小粒径纳米银比大粒径纳米银更容易诱发HepG2细胞产生DNA损伤、染色体丢失、染色体断裂、基因扩增与基因量的改变。体外微核试验和体内微核实验之间在不同特性纳米银遗传毒性强弱方面有良好相关性。胞质阻滞微核组学试验和微核实验测定纳米银引起HepG2细胞染色体畸变效应差异比较结果表明相比于传统的微核实验,胞质阻滞微核组学试验是一种可以用作测定纳米银遗传毒性的全面而灵敏的试验。由彗星实验与胞质阻滞微核组学试验结合,利用HepG2细胞作为体外评价模型,能方便快速检测纳米银材料以及市场上含银产品的遗传毒性效应。