研究目的:免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)是一种由自身抗血小板抗体介导的获得性自身免疫性疾病,巨噬细胞是血小板破坏和抗原提呈的关键细胞。基于这一病理特征,本研究以已连接抗血小板膜糖蛋白抗体(抗CD41单抗)的致敏血小板作为药物载体,携载长春新碱,构建靶向巨噬细胞的血小板载药体(CD41-PLT-VCR),利用抗体介导血小板可被巨噬细胞主动吞噬的特点,将长春新碱靶向运送到巨噬细胞内,杀灭巨噬细胞,进而达到提升血小板数量的目的,并进一步探讨其相关的作用机制,为临床ITP的靶向治疗提供理论及实验依据。研究方法:(1)将抗CD41单抗、长春新碱(VCR)和血小板(PLT)进行共聚合,优化浓度比和反应条件,构建靶向性好、载药率高、安全性佳的CD41-PLT-VCR载药体。用激光扫描共聚焦显微镜观察CD41单抗是否成功连接至载药体表面。通过高效液相色谱法(HPLC)测定该载药体的载药率和包封率,以及在不同pH环境下的药物体外释放特性。采用扫描电镜、凝集实验和Western blot法评价载药前后血小板形态和功能的变化。(2)体外实验中,流式细胞术、激光共聚焦显微镜检测巨噬细胞对CD41-PLT-VCR的吞噬率,HPLC检测巨噬细胞内VCR药物浓度。巨噬细胞分别用对照(control)、PLT、VCR、PLT-VCR 及 CD41-PLT-VCR 处理,CCK-8 法检测各处理组对巨噬细胞的活性抑制率,流式细胞术分析各组诱导巨噬细胞凋亡水平。(3)体内实验中,采用每日腹腔注射抗CD41单抗构建ITP小鼠模型,检测各组干预后ITP小鼠血小板恢复情况,评估CD41-PLT-VCR载药体疗效;检测各组小鼠一般情况及坐骨神经传导速度和病理改变,评价载药体的毒性和安全性。用HPLC测定血药浓度和药物组织分布情况,并进一步用流式细胞术检测肝脾巨噬细胞的数量及极化状态,初步探讨CD41-PLT-VCR载药体治疗ITP的相关作用机制。实验结果:(1)抗CD41单抗成功连接至CD41-PLT-VCR载药体表面。当血小板浓度为(2.0～3.0)×105/μl,长春新碱投药量为160μg/ml时,CD41-PLT-VCR载药体可获得最高载药率和包封率,分别为(46.40±1.68)%和(63.40±3.41)%,且载药前后血小板形态、凝集功能以及血小板特征性膜蛋白表达水平均未发生明显改变。CD41-PLT-VCR载药体具有pH敏感的体外释药特性,在酸性环境中能迅速释药,在pH=5的酸性环境中,36 h的药物释放率为(77.6±4.3)%,而在pH=7.4的环境中,36h的释放率仅有(38.9±4.6)%。(2)CD41-PLT-VCR载药体可被巨噬细胞主动吞噬,高效的将VCR靶向运输至巨噬细胞内。CD41-PLT-VCR处理的巨噬细胞,细胞内药物浓度可达投放药物的(30.72±3.11)%,远高于 PLT-VCR 组(21.63±2.17)%和游离的 VCR 组(18.0±1.87)%(P<0.01)。各组处理巨噬细胞72 h后,游离VCR组、PLT-VCR组和CD41-PLT-VCR组对巨噬细胞的活性抑制率分别为(47.87±4.92)%、(55.7±3.02)%和(73.06±5.26)%,凋亡率分别为(44.4±4.10)%、(54.55±5.03)%、(69.70±4.26)%,CD41-PLT-VCR组的活性抑制率和凋亡率均显著高于前两组(P<0.05)。(3)腹腔注射抗CD41单抗构建的ITP模型小鼠,外周血血小板可维持在(100～300)×109/L,脾脏体积明显增大,是正常的3.192±0.194倍(P<0.01)。抗体介导的血小板主要被脾脏巨噬细胞吞噬破坏,可基本模拟人ITP的发病过程。CD41-PLT-VCR载药体处理的ITP小鼠,血小板数量有明显回升,可达(720±197.98)×109/L,为正常值的60%以上,显著高于游离的VCR组(435±222.48)×109/L(P<0.05)。VCR组和对照组两组的体重分别为(16.49±1.14)g、(19.26±0.89)g,坐骨神经传导速度分别为(40.65±3.192)m/s、(59.10±1.350)m/s,和对照组相比,VCR组小鼠体重和坐骨神经传导速度均明显下降(P<0.01),坐骨神经纤维密度也明显降低,出现脱髓鞘改变。而CD41-PLT-VCR载药体组小鼠一般情况良好,坐骨神经传导速度为(67.58±8.005)m/s,未见明显减小,也未出现典型的病理改变。CD41-PLT-VCR载药体较游离的VCR在血液中维持的时间更长,在肝脾组织中药物浓度更高,在脾脏组织药物浓度可高达(0.225±0.041)μg/g,显著高于游离的长春新碱组(0.098±0.019)μg/g(P<0.01)。VCR可作用于肝脾的巨噬细胞,并使肝脾M2型巨噬细胞比例显著下降(P<0.05);而CD41-PLT-VCR载药体可使小鼠脾脏M1型巨噬细胞比例显著下降(P<0.05),对M2型巨噬细胞无明显影响。研究结论:本研究成功构建了 CD41-PLT-VCR载药体,其具有较高的载药率及包封率,且载药过程不影响血小板的形态和功能。CD41-PLT-VCR载药体可通过抗体介导作用被巨噬细胞大量吞噬,高效地将长春新碱靶向运送至巨噬细胞内,从而有效抑制巨噬细胞活性并诱导其凋亡。CD41-PLT-VCR载药体可显著提升ITP小鼠外周血血小板数量,并减轻长春新碱的全身毒性及周围神经毒性,具有良好的疗效和安全性,作用机制可能为CD41-PLT-VCR载药体通过FcγR靶向作用于ITP小鼠脾脏M1型巨噬细胞,使M1型巨噬细胞数量下降,从而减少其对血小板的吞噬破坏。该载药体有望为ITP的临床治疗提供有力的手段。