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重金属对生物的毒害机理及生物产生抗性的机制一直是重金属污染生态学的热点问题。过氧化胁迫往往是污染物对生物毒害的一个重要方面,目前,对于由Ni诱导的氧化胁迫对蓝藻等的毒害作用及生物对此的抗性机制等方面的研究较少。
因此,本文通过直接在铜绿微囊藻的基础培养基中添加不同浓度的Ni2+做重金属处理,以O2·-和MDA含量为指标阐明不同浓度处理对藻细胞O2·-的诱导及其所受到膜脂过氧化损伤的程度,揭示O2·-和MDA含量与Ni2+处理浓度之间的剂量—效应关系;同时探明以SOD、CAT、POD为代表的抗氧化酶系统在不同浓度Ni2+处理条件下的变化,了解铜绿微囊藻抗氧化酶系统对Ni胁迫的响应,探讨其在抵抗Ni胁迫中的作用。试验获得的主要结果如下:
(1)不同浓度Ni2+处理对铜绿微囊藻生长的影响表现为:低浓度(0~0.3mg/L)促进、高浓度(0.4~1.0mg/L)抑制,Ni2+浓度与铜绿微囊藻OD663nm之间存在明显的剂量—效应关系。OD663nm在Ni2+浓度为0.3mg/L时出现最大值(0.333),显著高于空白对照(0.266),比空白增加了25.188%。
(2)低剂量、长时间试验中Ni浓度处理诱导了铜绿微囊藻体内O2·-和MDA含量的增加,在高剂量、短时间ni处理下则表现为先升高、后降低。
①在低剂量、长时间试验中,当Ni2+浓度介于0~0.3mg/L时,随着Ni2+浓度的增加,铜绿微囊藻体内O2·-含量有降低的趋势,到0.3mg/L时显著低于空白对照(P<0.05),是对照O2·-含量(14.184A·g-1·FW)的83.28%。而随着Ni2+浓度的进一步增加,O2·-含量逐渐增加,在1.0mg/L浓度下,铜绿微囊藻体内O2·-含量(19.880A·g-1·FW)明显高于对照,达到极显著水平(P<0.01),是空白对照的1.4倍。
MDA含量随着Ni2+浓度的增加而逐渐增加,但是在≤0.4mg/L时增加并不显著,在Ni2+浓度升高到1mg/L时才出现了极显著增加(P<0.01),几乎是空白对照MDA含量(15.787μmol·g-1·FW)的4倍,指示铜绿微囊藻受到膜脂过氧化损伤。Ni2+浓度与MDA含量之间呈极显著正相关关系(r=0.874,P<0.01)。
②在高剂量、短时间试验中,10mg/LNi2+处理下O2·-含量在处理12h时达到最大值(21.710A·g-1·FW),比空白(8.429A·g-1·FW)增加了117.55%。随着时间的延长,O2·含量反而显著降低,并在48h时接近空白水平;而对于5mg/L的处理组,却是在处理了24h时才出现O2·-含量的峰值(14.622A·g-1·FW),比对照增加了73.47%,随后也表现出随时间延长而降低的现象,但是没有达到显著水平。5mg/L处理组O2·含量峰值出现的时间滞后于10mg/L的处理组,并且其峰值也比10mg/LNi2+处理下的峰值小,说明10mg/LNi2+处理对铜绿微囊藻体内O2·-的影响比5mg/LNi2+处理更为剧烈。
5mg/L和10mg/L两个处理剂量下铜绿微囊藻体内MDA含量的峰值均在处理12h时出现,分别是78.177μmol·g-1·FW和82.220μmol·g-1·FW,分别比对照增加了26.47%和33.01%,均达到了显著水平(P<0.05),然后随着处理时间增加而不断降低。其中,5mg/LNi2+处理下,MDA含量随时间延长而降低的幅度明显小于10mg/LNi2+处理,在处理了48h时接近于空白对照;而10mg/LNi2+剂量下,在处理了36h后MDA含量的积累就明显小于空白对照,48h时进一步降低。
O2·-和MDA含量在达到峰值后的回落,可能是由于Ni诱导的ROS及其诱发的膜脂过氧化作用对铜绿微囊藻的毒害作用超过了其能耐受的极限,引起铜绿微囊藻死亡,藻细胞分解所致。
(3)Ni处理诱导了铜绿微囊藻体内SOD、CAT活性的增加,提高了铜绿微囊藻抵抗氧化胁迫的能力,在抵抗Ni胁迫过程中产生了积极的保护作用。①在低剂量、长时间试验中,铜绿微囊藻SOD活性在低浓度(0.1~0.4mg/L)下随着Ni2+浓度的升高而增加,并在0.3mg/L处理时出现最大值(578.112U·g-1FW),比空白对照(268.570U·g-1FW)增加了115.256%,但在1.0mg/L时SOD活性急剧降低,接近对照水平,总体上SOD活性被诱导增加。CAT活性随着Ni2+浓度的升高而增加,二者之间呈现极显著正相关关系(r=0.925,P<0.01)。
②而在高剂量、短时间中,5mg/LNi2+剂量下处理了24h时铜绿微囊藻SOD活性达到最高(350.771U·g-1·FW),随后随着时间的延长,其活性没有发生显著变化,一直保持在较高水平。而对于10mg/LNi2+处理组,在处理了12h后,SOD的活性就达到最大(359.786U·g-1·FW),随后出现降低趋势,在36h时接近对照水平,48h时进一步降低,但不显著。
在5mg/LNi2+处理剂量下随着时间的延长,铜绿微囊藻CAT活性升高,在处理36h时显著高于对照,在48h时达到最大(28.176u·g-1·FW);在10mg/L剂量下则是在处理了12h出现最大值(38.177u·g-1·FW),但在24h时即出现显著降低,随后随着时间的延长,铜绿微囊藻CAT表现出不断降低的趋势,但始终保持在较高水平。
在整个试验过程中都没有检测到POD活性。这与高等植物抗氧化酶系统在抵抗重金属胁迫过程中的响应方式存在明显的差别。
(4)随着Ni2+浓度的升高,铜绿微囊藻可溶性蛋白含量逐渐降低,当Ni2+浓度达到0.4mg/L时,铜绿微囊藻可溶性蛋白含量出现极显著降低(P<0.01),在1.0mg/L时抑制作用更强烈。说明在高浓度Ni的胁迫下,铜绿微囊藻的蛋白质合成受到抑制,或其分解速度加快。
(5)首次确定铜绿微囊藻FACHB-905株含有Fe-SOD和Mn-SOD两种同工酶类型,其中以Fe-SOD为主,有两条同工酶带,且亮度较高;而Mn-SOD只出现一条带,且亮度较弱。两种类型同工酶的存在使铜绿微囊藻SOD同工酶类型显示出多样性,增强了铜绿微囊藻FACHB-905株对不利环境的耐受性和适应性,在一定程度上可以解释铜绿微囊藻在滇池中长期占绝对优势地位的原因。
不同浓度Ni处理对铜绿微囊藻SOD同工酶酶谱产生了明显的影响,但两种处理条件下都没有诱导新酶带的产生,即Ni处理只是导致了铜绿微囊藻SOD同工酶发生了量变,而没有发生质上的变化。
(6)Ni2+浓度的升高,导致铜绿微囊藻O2·-的含量增加,并诱导SOD和CAT的活性表达以清除细胞内的O2·-。过量的O2·-超过了SOD清除能力的极限并对其产生毒害,致使其活性明显降低,同时引发膜脂过氧化作用,对细胞膜产生严重损伤,最终影响藻细胞的生长,生物量显著降低。这是Ni通过诱导氧化胁迫对铜绿微囊藻产生毒害的机理及其内在过程。