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研究背景:术后复发是早期肺腺癌治疗失败的主要原因,辅助治疗是目前预防术后复发的主要手段,但其疗效并不理想,仍有30-50%的早期肺癌患者会在术后5年内死于复发性疾病。在当前辅助治疗手段没有突破性进展的情况下,准确地判断早期肺腺癌患者预后,让复发风险高的患者得到更积极的治疗是降低术后复发率的关键。然而目前临床应用的TNM分期系统在判断早期肺腺癌预后方面存在明显的局限性,它无法准确区分处于同一病理分期患者的复发风险。寻找能够准确预测早期肺腺癌患者预后的标志物,用以补充甚至替代TNM分期来指导术后治疗对降低早期肺腺癌复发率,改善患者预后具有重要意义。研究方法:我们使用大坪医院肺癌数据库和TCGA数据库分别构建早期肺腺癌研究队列,根据患者术后复发情况将纳入研究队列的病例分为复发和未复发两组。分别使用芯片和测序技术得到两个研究队列中复发与未复发组间差异表达的基因(Differential expressed genes,DEGs)和miRNAs,并对其进行基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)。我们将同时在两个研究队列中出现的差异表达基因和miRNA作为候选研究分子进行进一步验证和机制研究。而后我们再次利用大坪医院肺癌数据库和TCGA数据库构建大坪医院和TCGA早期肺腺癌验证集,通过免疫组织化学和PCR等实验手段得到候选研究分子在大坪医院验证集中的表达水平,结合TCGA验证集中RNA表达数据分别在蛋白和RNA水平对候选研究分子进行验证。我们首先利用卡方检验、Cox风险回归模型以及Kaplan-Meier生存分析等统计学方法分析候选研究因子的表达水平与复发率、无复发生存时间(Recurrence Free Survival,RFS)及总生存时间(Overall Survival,OS)等预后指标是否相关;而后通过基因干扰及过表达技术,我们分别在体外和体内环境下探索候选研究分子对肺腺癌细胞增殖、转移、铂类耐药等方面的影响;最后我们利用IP-质谱、Co-IP、mRNA测序、双荧光素酶报告基因等实验手段进一步探索候选研究因子参与调控早期肺腺癌术后复发的分子机制。研究结果:1.通过差异表达分析,我们在大坪医院研究队列和TCGA研究队列中分别得到734和229个符合p<0.05且|Fold change|≥1.5筛选标准的DEGs。GSEA分析显示MITOTIC_SPINDLE和GLYCOLYSIS基因集分别在TCGA和大坪医院复发组中显著富集并上调。在两个研究队列中同时出现差异表达的基因有SFTPB,SFTPD,SFTA1P,HLA-DQB1,ITGB8,ANLN,LRRN1等7个,而同时出现差异表达的miRNAs有miRNA-485-5p,miRNA-376c-3p,miRNA-493-3p,miRNA-134-5p,miRNA-495-3p等5个。2.在大坪医院和TCGA验证集中,卡方检验、Cox回归模型及Kaplan-Meier生存分析结果显示HLA-DQB1,SFTPB和miRNA-134-5p等三个分子均与早期肺腺癌术后复发率及RFS或OS显著相关。3.在大坪医院验证集中肺腺癌肿瘤细胞表达HLA-DQB1水平与肿瘤组织CD4+,CD8+T淋巴细胞浸润程度呈正相关,同样,在TCGA验证集中HLA-DQB1水平与肿瘤组织淋巴细胞浸润比例、CD4、CD8、GZMH、GZMK等免疫相关分子表达水平呈正相关。4.体外及体内实验均证实SFTPB表达水平与肺腺癌细胞增殖和迁移能力呈负性相关。GSEA分析结果显示AKT下调相关基因在SFTPB高表达患者中显著富集上调。TCGA数据分析及肿瘤标本、细胞模型研究结果均提示AKT磷酸化水平与SFTPB呈显著负相关。IP-质谱及Co-IP实验结果证实磷酸甘油酸激酶1(Phosphoglycerate kinase1,PGK1)与SFTPB在肺腺癌细胞内有结合作用。TCGA数据显示PGK1与AKT磷酸化水平呈正相关而与SFTPB水平呈负相关,细胞实验也进一步证实过表达SFTPB使细胞PGK1水平显著降低。5.Transwell、CCK8等细胞实验及动物实验均显示在肺腺癌细胞中miR-134-5p表达水平与细胞迁移、侵袭及对铂类耐药等能力呈正相关。通过mRNA测序及查阅miRNA靶基因预测网站,我们发现DAB2基因是miR-134-5p的下游靶基因,肿瘤组织检测及细胞实验也证实miR-134-5p与DAB2的表达呈负相关。双荧光素酶报告基因实验显示miR-134-5p直接作用于DAB2的启动子序列靶向调控DAB2。进一步对TCGA数据进行分析显示高表达DAB2的早期肺腺患者术后复发率更低,中位RFS更长。在肺腺癌细胞中过表达或敲低DAB2会影响肿瘤细胞E钙黏蛋白(Ecadherin)的表达并影响细胞迁移及对铂类耐药能力。最后共转染实验结果显示DAB2能够逆转miR-134-5p促进肺腺癌细胞转移及耐药的作用。研究结论:1.SFTPB,SFTPD,SFTA1P,HLA-DQB1,ITGB8,ANLN,LRRN1等7个基因和miRNA-485-5p,miRNA-376c-3p,miRNA-493-3p,miRNA-134-5p,miRNA-495-3p等5个miRNAs在大坪医院和TCGA两个研究队列的术后复发与未复发组间均存在差异性表达;2.糖酵解相关基因在大坪医院复发组患者中富集上调,而有丝分裂相关基因在TCGA复发组中富集上调;3.早期肺腺癌患者肿瘤细胞(而非间质细胞)高表达HLA-DQB1与较低的术后复发风险及更长的RFS和OS显著相关,其机制可能与机体抗肿瘤免疫激活有关;4.SFTPB具有负向调控肺腺癌细胞增殖及迁移的作用,高表达SFTPB与早期肺腺癌患者较低的复发率和更长的RFS和OS显著相关;5.在肺腺癌细胞中SFTPB与PGK1结合,可能通过促进其泛素化降解进而抑制AKT/mTOR信号通路活化,抑制肿瘤细胞的增殖及迁移能力,最终影响早期肺腺癌预后;6.MiR-134-p具有促进肺腺癌细胞转移和对铂类耐药的作用,导致高表达miR-134-5p的Ⅰ期肺腺患者预后不良;7.在Ⅰ期肺腺中,DAB2是miRNA-134-5p的下游靶基因,DAB2可通过调节肿瘤细胞的上皮间质转化(Epithelial–Mesenchymal Transition EMT)进而介导miR-134-5p发挥促肿瘤转移和铂类耐药作用。