论文部分内容阅读
目的循环血液中活性肿瘤细胞的检测被看作是液体活检,具有动态监测的功能,在肿瘤早期诊断、个体化治疗、疗效评价、预后判断等方面具有重要的临床意义,然而由于其在血液中数量很少,循环肿瘤细胞(circlulating tumor cells,CTCs)的分离和鉴定成为临床应用的难点。复制选择性溶肿瘤腺病毒Ad11-5ETel-GFP是一种通过同源重组获得的病毒,可以选择性的在具有端粒酶活性的细胞内复制并表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)。本研究旨在利用该病毒捕获循环肿瘤细胞,从而建立一种可重复、简单、无创的检测方法,并对该检测方法的可靠性和临床应用价值进行探讨。方法首先通过实验验证我们所建立的方法能够有效捕获到肿瘤细胞,包括:将AD11-5ETel-GFP病毒加入正常人外周血中,观察GFP在正常白细胞的表达情况;将A549(肺癌细胞系),SKBR3(乳腺癌细胞系)分别以10、50、100个细胞三个梯度加入1ml人外周血中,建立循环肿瘤细胞的模型并检测其回收率;使用抗人CD45抗体进行细胞免疫染色,荧光显微镜下观察结果。以上结果说明本实验建立的新型检测方法能有效的捕获循环细胞。将该方法应用于头颈部恶性肿瘤的患者,收集临床标本48例,将标本中红细胞裂解,加入病毒于37℃条件下孵育24h,固定涂片后于荧光显微镜下观察计数。并分析不同临床参数头颈部肿瘤患者术前外周血CTCs的检出情况。结果1.复制选择性溶肿瘤病毒不感染正常人白细胞。2.分别于正常人外周血中加入的10,50,100个A549、SKBR3细胞,其检出率分别为77.5%,84.0%,80.25%;80.0%,82.5%,81.25%,应用pearson卡方检验比较两组间差异,结果显示用溶肿瘤腺病毒法检测两组不同的肿瘤细胞,其检出率无显著差异,即本实验所研究的方法对各肿瘤细胞系均敏感且回收率较高。并通过细胞免疫染色实验进一步验证所捕获的细胞为循环肿瘤细胞。3.在收集的48例头颈部恶性肿瘤的临床标本中,19例患者CTCs阳性,检出率为39.6%,且CTCs的检出率与性别、年龄、肿瘤分期、肿瘤的发病部位、淋巴结转移与否等临床参数无关,与肿瘤分化程度相关,肿瘤分化越差,CTCs的检出率越高。结论本研究建立了一种新型循环肿瘤细胞的检测方法,初步确定了溶肿瘤腺病毒检测CTCs的标准,并对该方法的可靠性及临床应用价值进行了评估。该方法能够特异性示踪循环肿瘤细胞,具有重要的临床应用价值。