asy是本实验室发现的一个内质网定位的凋亡诱发基因,hap(homologue of ASY protein)是从人胚肺cDNA文库中克隆的ASY结合蛋白基因(Li et al,2001;Qi et al,2003),当时称这一基因为asyip( ASY interacting protein)。序列分析表明HAP和ASY都属于RTN家族,HAP为RTN3,ASY为RTN4B,也称为NogoB。多年以来,本室已对hap基因的转录调控,HAP蛋白的结构、同源异源聚合作用、凋亡诱发功能和内质网应激等进行了大量的研究,为了进一步研究RTN3/HAP参与的细胞凋亡信号转导途径及网络调控,本论文着重分析了RTN3与几种蛋白的相互作用及其功能,阐述了RTN3参与的多种凋亡信号转导途径和各个途径之间的交叉,也初步论述了RTN3与一个AVSD( Atrioventricular septal defects)风险致病基因产物的作用及对细胞的增殖和凋亡的影响,初步揭示了RTN3与AVSD之间的分子机制。本室的刘青珍博士曾用酵母双杂交系统筛选出果蝇的FADD(dFADD)能与人的RTN3(hRTN3)相互作用。为了进一步证实人的FADD与RTN3的作用,首先我们构建了二者的真核表达载体,运用免疫共沉淀的方法研究它们的相互作用,结果证实二者在哺乳动物细胞内是可以结合的。内源性的FADD能与内源性的RTN3或过表达的RTN3发生相互作用;而对RTN3和FADD相互作用功能区的鉴定实验说明:RTN3的C-端45个氨基酸和FADD的DD区是二者的结合区,这两个区域的缺失将使两种蛋白不能结合;当内质网定位的RTN3过表达时,FADD被招募到内质网上形成复合物,随后激活了caspase-8,Bid被切割为t-Bid,使Cyto c从线粒体释放出来;激光共聚焦实验证明FADD与RTN3在内质网上存在明显的共定位;衣霉素(tunicamycin,TM)刺激下,内源性的FADD被招募到内质网上与RTN3形成复合物,使FADD在内质网上的分布增多,RTN3与FADD的相互作用能影响TM诱发的细胞凋亡和caspase-8的活化。许多的研究表明,FADD在多种死亡受体介导的凋亡信号转导通路中起着重要的作用,Bid是线粒体凋亡途径的重要因子,我们以前证明,过表达的RTN3将引起内质网应激,内质网Ca2+排空,激活caspase-12,内质网定位的RTN3在内质网凋亡信号途径中十分重要,结合本研究结果,我们认为:以RTN3过表达为中心,细胞凋亡的死亡受体信号途径、线粒体信号途径和内质网途径在此发生了对话,形成细胞凋亡途径的信号网络。与此同时我们还发现NogoB也能与FADD作用,而引起FADD途径相关的Cyto c的释放。另外,在本室研究基础上,本文对RTN3与Bcl-2的相互作用和蛋白定位进行了深入的研究。一直以来,Bcl-2被认为是一个主要在线粒体上起作用的重要的凋亡抑制蛋白,它能与Bcl-2家族中的多种蛋白在线粒体上相互作用。本研究发现RTN3作为一个主要定位在内质网且不属于Bcl-2家族成员的蛋白,不仅能在体外和Bcl-2互相结合,而且,提取细胞的亚细胞组分用于免疫共沉淀实验,结果表明:在哺乳动物细胞中RTN3与Bcl-2结合在内质网上。转染外源的Bcl-2和RTN3到HeLa细胞,流式检测发现,RTN3的过表达会导致细胞凋亡,Bcl-2能抑制由外源的过表达RTN3诱发的细胞凋亡。为了更好的研究二者的相互作用,我们用G418筛选得到了稳定表达Bcl-2的HeLa细胞株(BH4),在BH4中,无论是瞬时转染RTN3导致的蛋白表达增加,还是衣霉素刺激引起的RTN3表达的上调都能促进Bcl-2的凋亡抑制活性,并且使细胞的凋亡率降低。Bcl-2参与的线粒体凋亡途径与RTN3介导的内质网凋亡途径因为这两种蛋白的相互作用而发生了交联。内质网定位的RTN3通常被认为是一个诱导细胞凋亡的蛋白,我们对它除凋亡以外的生理功能知之甚少。鉴于RTN3在很多组织中的高表达,我们很难想象在没有外界或自身信号刺激的情况下,高表达的RTN3会诱导细胞凋亡。本研究发现在AVSD中起着重要作用的细胞黏附分子――CRELD1 (cysteine rich with EGF like domains 1)作为AVSD2的首个散发性致病风险基因的产物,pull-down实验表明它能在体外和RTN3结合;而细胞免疫共沉淀实验也证明,在CRELD1过表达的情况下,CRELD1能与过表达或内源的RTN3在细胞质膜上发生相互作用,二者的作用改变了RTN3的内质网定位,流式细胞仪检测到细胞表面的RTN3蛋白增多;激光共聚焦结果显示CRELD1与RTN3在细胞质膜上有共定位,二者的结合使RTN3较集中的分布在细胞质膜上;MTT实验发现CRELD1与RTN3的相互作用影响了细胞的生长增殖,RTN3过表达是抑制细胞生长的,而CRELD1的外源性过表达减弱了RTN3对细胞生长的这种抑制;对于过表达RTN3诱发的凋亡,CRELD1与RTN3的作用较大的抑制了细胞凋亡,而衣霉素的刺激能减弱二者的相互作用,使凋亡细胞增多。我们以前的结果证明RTN3的凋亡诱发功能依赖于它的内质网定位,本文的结果表明当RTN3被CRELD1拉离内质网时,细胞的凋亡减弱了,可见RTN3的内质网定位对其凋亡功能的发挥是至关重要的,增加它在内质网的定位会加剧细胞凋亡,而减少它在内质网的分布能部分抑制由RTN3过表达而引起的细胞凋亡。这些结果不仅使我们能更好的了解RTN3,而且为AVSD疾病的分子机制研究提供了较好的线索。