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目的：细胞粘附及移行是角膜上皮伤口愈合的关键,该过程依赖于整合素(Int)及其配体纤维连接素(FN)的信号作用系统。角膜上皮素(BIGH3)蛋白对调节人角膜上皮细胞(HCE)粘附和迁移起着非常重要的作用。本研究通过对野生的人BIGH3基因进行结构改造,研究改造前后的BIGH3对培养的HCE粘附、迁移及细胞划痕愈合作用；同时摸索重组人角膜上皮素(rhBIGH3)的最佳表达条件,为大规模rhBIGH3的生产提供了实验依据。
方法：(1)培养人成纤维细胞,通过RT-PCR法获得全长人角膜上皮素基因,测序鉴定,并将其克隆至pET32a+原核表达载体中。(2)运用快速定点诱变PCR的方法,在人角膜上皮素基因中生产编码RGDRGD(Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Asp)的碱基序列。(3)按所优化的条件进rhBIGH3的诱导表达,包涵体的提取,洗涤,变性,复性。(4)活性检测：培养兔角膜细胞,细胞粘附实验观察改造前后的重组角膜上皮素对兔角膜细胞的作用。(5)细胞实验：细胞粘附、迁移试验和划痕实验观察改造前后的角膜上皮素对HCE系的作用及与RGD及整合素α3β1的关系。
结果：(1)成功的从人成纤维细胞中逆转录出人BIGH3基因,并构建其原核表达载体。(2)成功的在野生人角膜上皮素基因内诱导产生编码RGDRGD的碱基序列。(3)在16℃、150r/min条件下成功诱导表的了BIGH3蛋白,每升培养基可获得rhBIGH3 8mg,rhBIGH3在大肠杆菌中的表达量超过总菌体蛋白的60％,纯化后的蛋白纯度超过95％。(4)细胞实验：细胞粘附和迁移试验表明,rhBIGH3以剂量依赖式方式促进人HCE细胞的粘附与迁移。在rhBIGH3浓度达到10μg/mL时,开始促进HCE细胞粘附与迁移,随着浓度的增高,作用增强；浓度达到30μg/mL时,促进作用达到高峰：细胞划痕实验证明了,浓度达到30μg/mL时,rhBIGH3能够明显促进细胞划痕愈合。在抗BIGH3、GRGDSP肽、整合素α3β1抗体存在条件下,其促进细胞粘附、迁移及划痕愈合的作用受到抑制,具有统计学意义。
结论：(1)产生了RGDRGD序列的诱变型人角膜上皮素比野生型角膜上皮素拥有更高的促角膜上皮损伤愈合活性。(2)本实验所优化的诱导表达条件及生产工艺路线可获得高纯度、高活性的rhBIGH3蛋白,为进一步临床应用提供了技术条件。