唾液酸是一种以九碳糖为基本骨架的糖类化合物的统称,在生物体中以糖缀合物的形式存在。目前已知的唾液酸已有50多种,Neu5Ac和Neu5Gc是其中最主要的两种。对于人体而言,Neu5Ac属于内源性唾液酸,人体可以自行产生,其常存在于大脑及神经细胞的表面,可以促进大脑的智力发育,属于有益唾液酸;而Neu5Gc是一种人体自身无法合成的外源性唾液酸,通常通过膳食途径进入人体,被人体识别为外来抗原并引起免疫反应,进而产生抗体,而该抗体的长期积累会产生炎症反应,进而诱发各种疾病,因此Neu5Gc是一种有害唾液酸。红肉是膳食中结合态Neu5Gc含量较高的一种食品,因此研究各种红肉中Neu5Gc的含量可以为人们膳食比例的调节提供参考依据。对于红肉中Neu5Gc的定量,本实验室以前采用X-Gal-Neu5Prop为内标通过液相进行检测,因为Neu5Gc和Neu5Prop的分子结构不同,而液相对于不同结构的物质响应值也不同,因此,此方法存在一定误差。为了更好的对红肉中的Neu5Gc进行定量,我们合成了一种结构与Neu5Gc更接近的新内标氘原子标记的X-Gal-Neu5GcD,并利用该内标对红肉中的Neu5Gc进行定量检测。1.同位素氘标记的内标X-Gal-Neu5GcD的合成、洗化及检测利用一釜多酶法,以羟乙跌氨基葡萄糖(GlcNGc)和X-Gal等为底物,通过异构酶(Epimerase)、唾液酸醛缩酶(Sialic acid aldolase)、CMP-Sia 合成酶(CMP-Sialic acid synthetase)、唾液酸糖基转移酶(Sialyltransferase)四种酶的反应可以合成正常的产物X-Gal-Neu5Gc;如果将整个反应里的普通水全部用重水来取代,则合成产物中,Neu5Gc上的三个氢原子将被氘原子取代,最终可以合成含有氣原子标记的X-Gal-Neu5GcD.通过C18固相萃取柱和硅胶柱的纯化,以及LC-MS、UPLC的检测,证实我们得到了较纯的正常的X-Gal-Neu5Gc及被氘原子标记的X-Gal-Neu5GcD。2.同位素内标X-Gal-Neu5GcD的定量分析对已合成的含有氘原子标记的X-Gal-Neu5GcD用商品化的正常Neu5Gc进行定量。定量时,先比较LC-MS的SIM和SCAN两种检测模式,证明SIM模式对于Neu5Gc的检测更加灵敏,然后将X-Gal-Neu5GcD上的Neu5GcD水解下来,与已知浓度的正常Neu5Gc同时进行LC-MS检测,通过比较质谱峰面积从而计算出含有三个氘原子标记的X-Gal-Neu5GcD的浓度为3.82mmol/L。3.红肉中Neu5Gc的定量测定本章分别以本实验室之前合成利用的X-Gal-Neu5Prop和新合成的X-Gal-Neu5GcD为内标对红肉中Neu5Gc进行定量测定的比较,证明以同位素标记的X-Gal-Neu5GcD为内标进行定量的方法是可行的,并且可以消除液相对于不同结构的物质响应值不同而引起的测定误差。此外因为膳食中游离态和结合态Neu5Gc的含量以及对人体产生的影响都不同,因此本章用同位素内标法对红肉中结合态及游离态Neu5Gc的含量进行了测定比较。得到了以氘原子标记的X-Gal-Neu5GcD为内标的方法检测出的红肉中不同状态Neu5Gc的含量及比例。