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背景与目的：胃镜加活组织检查是目前诊断胃癌的主要手段,但由于痛苦大、费用高而难以用于胃癌的筛查诊断。血清肿瘤标志物检测是简便实用的肿瘤筛查诊断手段,但胃癌缺乏有临床应用价值的标志物。SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技术是一项组合化学新技术,用于从人工合成的单链随机寡核苷酸文库中筛选出能与靶分子高特异性、高亲和力结合的核酸配体(适配子)。适配子的功能可媲美或优于抗体,但化学性质比抗体稳定,在疾病的诊断中有良好的应用前景。本研究采用SELEX技术筛选胃癌血清适配子,并对适配子与胃癌血清结合的特异性和亲合力进行分析,旨在为建立基于适配子的胃癌诊断新技术奠定基础。方法：1.血清标本收集：收集一批前来南昌大学第一附属医院就诊的胃癌、良性胃病患者的血清标本,同时收集一批前来进行健康体检的正常人的血清标本。2.常用血清肿瘤标志物对胃癌的诊断价值评价：通过常规统计分析、受试工作特征(ROC)曲线及曲线下面积(AUC)、单/多因素Logistic回归分析等方法,评价血清肿瘤标志物AFP、CEA、CA125和CA19-9单项或联合检测对本组胃癌病例的诊断价值。3.胃癌血清适配子的筛选：(1)制备靶血清：选择15例经病理确诊的术前胃癌患者的血清和15例健康体检未发现异常者的血清,并分别等比例混合制备成胃癌混合血清和正常混合血清(消除个体之间的异质性),用作SELEX筛选的靶血清。(2)合成文库及引物：沿用我们以往设计的单链随机DNA文库及相应的引物,由生物试剂公司合成。(3)正常血清消减SELEX筛选：将文库与正常混合血清孵育,然后进行12%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及GelRed染色,切胶回收和纯化游离ssDNA,不对称PCR扩增制备亚文库用于下一轮筛选。重复3轮消减SELEX筛选。(4)创建单引物限制性扩增法制备亚文库：因不对称PCR扩增制备亚文库时存在明显非特异性扩增而建立了本方法。以第3轮消减筛选后制备的ssDNA亚文库为模板,以模板量5倍的单下游引物扩增制备负链,再以负链为模板,以模板量10倍的单上游引物扩增制备正链。扩增产物进行PAGE及银染定性鉴定、real-time PCR定量,并与不对称PCR扩增产物进行比较。(5)胃癌血清正向SELEX筛选：将胃癌混合血清与3轮消减筛选后的亚文库进行孵育,12% PAGE分离并切胶回收与血清结合的核酸,单引物限制性扩增法制备亚文库用于下一轮筛选。共进行9轮正向SELEX筛选。4.适配子分离及其结构分析：以第9轮正向筛选后回收的结合核酸为模板进行对称PCR扩增,送生物公司克隆分离核酸片段并测序。序列与文库吻合的核酸片段为适配子。采用RNA Structure 4.6软件进行适配子的二级结构模拟分析。5.适配子的特异性分析：用梯度浓度的适配子分别与胃癌混合血清和正常混合血清孵育,然后进行12% PAGE及GelRed染色,观察适配子与血清的结合情况,分析适配子与胃癌血清结合的特异性。6.适配子的亲和力分析：将梯度浓度的适配子与胃癌混合血清孵育,然后进行12% PAGE及GelRed染色,Quantity One软件测定适配子特异结合带的灰度值,用Graphpad prism 5.01软件作图计算Kd值。结果：1.研究对象：共收集149例胃癌(男115例,女34例,平均年龄59.1岁)、111例良性胃病(男76例,女35例,平均年龄52.9岁)及124例健康对照(男72例,女52例,平均年龄53.0岁)的血清标本。2.常用血清肿瘤标志物对胃癌的诊断价值：胃癌组血清CEA、CA125、CA19-9水平高于良性胃病组及健康对照组。以正常值为界值,4种标志物单项及联合检测诊断胃癌的敏感度为4.7%-20.8%,联合检测为40.3%。采用最佳界值,CEA、CA125、CA19-9单项诊断胃癌敏感度有所提高,其中CEA的敏感度从17.4%升至58.4%,联合检测达到69.1%,但特异性明显下降,由99.1%下降到83.4%,联合检测为80.4%,阳性似然比和阴性似然比变化不大,表明常用血清标志物单项或联合检测对胃癌的诊断价值有限。3.胃癌血清适配子筛选与分离：经过3轮消减和9轮正向SELEX筛选,克隆分离出22条核酸序列,它们两端的固定序列与文库序列相同,中间的随机序列各不相同,表明成功筛选出一组胃癌血清适配子4.适配子的二级结构特点：适配子的二级结构模拟分析显示结构多样,有口袋形、发卡形、棒形和球拍形等,提示这些适配子针对胃癌血清中不同的靶标或靶标结合位点。5.适配子的特异性分析：多数适配子与胃癌血清的结合带强于正常血清,其中4个适配子存在与胃癌血清的特异结合条带,为特异性较好的胃癌血清适配子,有进一步研究的价值。6.适配子的亲和力分析：对胃癌血清特异性条带明显的2个适配子进行了亲和力分析,Kd值分别为分别为3.798 nM和0.871 nM,表明筛选的适配子与胃癌混合血清具有良好的亲和力。7.单引物限制性扩增法制备ssDNA亚文库：单引物限制性扩增法非特异扩增出现晚,产物纯度高,而不对称PCR法非特异性扩增出现早,优势杂带明显多于目的条带。单引物扩增法扩增产量是不对称PCR扩增的16.1倍。结论：本研究得出以下结论：(1)常用血清肿瘤标志物AFP、CEA、CA125和CA19-9单项和联合检测对胃癌的诊断价值有限,有必要开展简便实用的胃癌诊断新方法研究。(2)以复合靶消减SELEX筛选,筛选出22个胃癌血清适配子,各适配子模拟二级结构多样,其中4个适配子与胃癌混合血清存在特异性结合带,且与胃癌血清结合的亲和力强,提示成功筛选出胃癌血清适配子,并具有潜在的诊断应用价值。(3)创建了单引物限制性扩增法制备随机单链寡核苷酸亚文库的方法,有效地克服了SELEX筛选过程中亚文库PCR扩增中的非特异产物干扰问题,明显优于不对称PCR法制备亚文库,是一种有良好应用价值的单链随机寡核苷酸亚文库制备新方法。