目的:胰蛋白酶原(Trypsinogen,TRY)是动物消化蛋白质不可或缺的一种酶。近年来有研究发现胰蛋白酶原不仅具有消化功能,它还扮演着其它功能。为更好的了解TRY的功能,本试验对TRY进行了基因克隆分析,原核表达及其在黄羽肉鸡体内的表达和分布情况的研究,研究结果可为肉鸡消化吸收功能研究提供理论基础。方法:(1)采用分子克隆技术克隆黄羽肉鸡胰蛋白酶原基因,并运用生物信息学软件对黄羽肉鸡TR蛋白质结构和功能进行预测和分析。(2)采用原核表达技术,进行目的蛋白表达;利用亲和层析法纯化目的蛋白,将纯化后的目的蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗TRY多克隆抗体。(3)利用免疫组织化学法、反转录PCR技术和荧光定量PCR技术分析TRY基因在黄羽肉鸡体内的分布情况,及不同生长发育阶段黄羽肉鸡胰腺组织中TRY基因表达的情况。结果:本试验成功克隆了黄羽肉鸡TRY基因,该基因开放阅读框全长747bp,由248个氨基酸残基组成,其中包含15个氨基酸的信号肽(MKFLVLVAFLGVA VA)和10个氨基酸(FPISDEDDDK)的激活肽;该蛋白的分子量为26.1ku,属于疏水性蛋白,不存在跨膜区,不含糖基化位点,有11个磷酸化位点。氨基酸序列比对结果显示:黄羽肉鸡TRY具有丝氨酸蛋白酶的保守结构特征,如含有催化三联体氨基酸(组氨酸-64,天冬氨酸-110和丝氨酸-203);具有构成6个二硫键所需的12个半胱氨酸残基等。序列一致性分析发现,黄羽肉鸡TRY与原鸡的同源性最高,高达98.8%。经反转录PCR、酶切和测序分析表明,黄羽肉鸡TRY基因原核表达重组质粒构建成功。将构建好的重组质粒转染至BL21感受态细胞,采用SDS-PAGE电泳检测分析显示,重组蛋白诱导表达成功,最佳诱导条件为:37℃,200r/min,IPTG=0.8 mmol/L,诱导时间24h。通过亲和层析法纯化蛋白,梯度咪唑进行洗脱,结果表明160mM浓度的咪唑洗脱效果最好。利用免疫组化、反转录PCR和荧光定量PCR法探讨TRY基因在黄羽肉鸡体内分布情况,结果表明:(1)TRY基因在消化系统、神经系统、免疫系统、生殖系统等均有分布,以胰腺表达量最高,且雌雄黄羽肉鸡均有此分布特点。(2)TRY基因不仅具有组织分布的广泛性,还具有性别差异性与组织差异性。利用免疫组化、反转录PCR和荧光定量PCR法对胰腺组织RY基因与黄羽肉鸡生长发育的关系进行了研究探索。结果表明:(1)雌雄黄羽肉鸡存在相似的表达特点,TRY基因在1日龄即开始表达,且随着黄羽肉鸡的生长发育,其表达量也随之增加,在14日龄时,其表达量极显著提高。(2)胰腺组织TRY基因具有性别差异性。2周龄后,雄性黄羽肉鸡的表达量高于雌性的表达量。其中,14日龄差异显著(P<0.05),35日龄和56日龄差异极显著(P<0.01)。结论:1.本试验成功克隆了黄羽肉鸡胰蛋白酶原基因,通过体外表达获得了肉鸡TRY蛋白,并成功制备了高效价的兔抗鸡胰蛋白酶原多克隆抗体。2.黄羽肉鸡胰蛋白酶原基因在消化系统、神经系统、免疫系统、生殖系统等均有分布,以胰腺表达量最高。3.黄羽肉鸡胰蛋白酶原基因在1日龄即开始表达,其表达量随日龄增加而提高。4.黄羽肉鸡胰蛋白酶原基因表达量与性别有关。2周龄后,雄性黄羽肉鸡表达量显著高于雌性黄羽肉鸡表达量。